竹红菌素的研究进展

徐 倩，任清褒，张 燕，夏更寿*

（1.丽水学院生态学院,浙江丽水323000;2.丽水学院工学院,浙江丽水323000）

竹红菌素（Hypocrellin）是肉座菌科的竹红菌和竹黄菌等少数几种竹寄生菌的次生代谢产物，属于苝醌类衍生物，目前主要来源是通过菌丝体内次级代谢合成途径产生。作为苝醌类化合物，其结构赋予它一定的光动力活性，表现出较好的光疗作用。因此近年来研究热点大多集中在光敏杀伤肿瘤细胞和抑制病毒等医学领域，以及光活化农药、光电转换材料等的开发利用方面。本文综述了竹红菌素的最新研究进展，重点阐述了竹红菌素在生物合成途径、应用、产量优化等方面的进展情况。

1 竹红菌素主要天然来源

竹红菌素是由万象义等人[1]在1980年首次从药用真菌竹红菌的肉质子实体中分离出来的新苝醌类化合物，因源自竹红菌而得名。而后在1991年，Kishi等人从另一个药用真菌竹黄菌中也分离得到竹红菌素[2]。

竹红菌和竹黄菌等少数几种竹寄生菌是竹红菌素的天然来源。其中竹黄菌（Shiraia bambusicolaP.Hennings）主要分布在中国浙江、江苏、安徽等省份，在日本、斯里兰卡也有分布。浙江省内的11个地级市均有分布，在天目山、莫干山、天台山、四明山、百山祖等主要山脉都有发现，其中以杭州、湖州、丽水等地区的分布较广，产量也较大[3]。它是我国传统的重要药用真菌，属于囊菌亚门（Ascomycotina）肉座菌科（Hypocreaceae）竹黄属（Sharaia），主要在苦竹、短穗竹、雷竹、白纹短穗竹等竹类植物的细嫩枝干上寄生，以短穗竹最为普遍，寄生率最高，产量最大，且只特异地寄生在前一年生的枝条上[4-5]。竹黄菌子座成熟时偏黄，表面光滑，红色物质逐渐积累呈粉红色，质地松软，多为纺锤形或不规则瘤状、块状，表面有细密纹理及针尖大小的斑点[6]。通常以肉质子座入药，其中竹红菌素类成分的含量是衡量竹黄药材质量的重要指标，近年通过代谢组学技术检测出其他一些具有重要药理作用的物质，例如黄酮类、香豆素类及肉桂酸类等[7-8]。内源性真菌Penicillium chrysogenum、Phaeosphaeriasp等经发酵分离也可得到竹红菌素、痂囊腔素等苝醌类化合物[9-10]。因此，竹红菌素主要来自于寄生菌，同时也是寄生菌药用价值的主要成分之一。

2 竹红菌素的结构、合成途径与调控

苝醌类化合物是一类分布在自然界生物中的光敏色素。苝醌类衍生物（Perylenequinonoid derivatives，PQDs）是以苝醌为母核的化合物，含有5个共轭生色环，颜色较深，包括竹红菌素（Hypocrellins）、尾孢素（Cercosporin）、痂囊腔菌素（Elsinochromes）、弗莱菌素（Phleichrome）和金丝桃素（Hypericin）等一系列的化合物[11]。竹红菌素则是多种苝醌类衍生物的混合物，主要包括竹红菌甲素（Hypocrellin A，HA）、竹红菌乙素（Hypocrellin B，HB）、竹红菌丙素（Hypocrellin C，HC）、竹红菌丁素（Hypocrellin D，HD），在天然竹红菌素中竹红菌甲素含量为95%，远大于竹红菌乙素，在合适的条件下两者可以相互转化。

竹红菌素的生物合成途径仍不十分明确，目前认为主要是通过聚酮类化合物途径合成，途径中相关基因也陆续被详细注释[12]。Zhao等人对比竹红菌素产量高的野生型S4201-W和产量低的突变体S4201-D1两个竹黄菌的转录组数据发现，有716个Unigenes在突变体中表现为上调，同时有188个基因表现出下调，其中有7个基因参与了HA的生物合成，包括多铜氧化酶（Multicopper oxidase）、成束蛋白（Fasciclin）、聚酮合成酶（Polyketide synthase）、甲基转移酶/FAD依赖性单加氧酶（O-methyltransferase/FAD-dependent monooxygenase）、甲基转移酶（O-methyltransferase）、羟化酶（Hydroxylase）和FAD/FMN依 赖 氧 化 还 原 酶（FAD/FMN-dependent oxidoreductase），并初步推断HA可能的生物合成途径及关键基因[13]。另外，一些真菌全局性的调控因子、转运蛋白等也参与次生代谢产物HA的生物合成，如光依赖型调节因子veA[14]、转运蛋白（MFS）[15]等。

对竹红菌素生物合成途径相关基因的功能验证研究也已陆续开展。在分别敲除编码聚酮合成酶（PSK）、单加氧化酶（MONO）、转录因子（ZFTF）基因的CRISPR转基因菌株中竹红菌素合成明显受到抑制，合成相关基因的表达量都显著降低，初步验证了这3个基因表达水平与竹红菌素合成呈正相关关系。在过表达多铜氧化酶基因（MCO）的菌株中，竹红菌素合成的多个基因表达量上升，竹红菌素产量相比于野生型提高了5倍[16]。从分子水平解析竹红菌素生物合成途径，可以更深入地了解竹红菌素，并为后续生物合成与调控的分子机理研究提供重要的参考，也为合理地利用竹黄等真菌资源提供新的途径。

3 光敏的作用机制与应用

光敏剂能在光和氧气的作用下产生活性氧(ROS），活性氧有较强的氧化能力，在细胞中攻击一些生物大分子如DNA、蛋白质、脂类等，引起一系列细胞内生理生化的变化，如细胞膜的劣变、细胞骨架损伤、阻断细胞正常的周期等，因而对细胞具有明显的杀伤作用。光敏活性的主要机理有两种:分别是type I和typeⅡ机制，其中typeⅠ机制主要发生在无氧环境下，经电子传递产生的活性氧主要有超氧阴离子自由基（O2）和羟基自由基（·OH）；typeⅡ机制主要发生在有氧条件下，通过产生单线态氧（1O2）与生物大分子物质结合[17-18]。

竹红菌素是一种新型的光疗光敏剂，其药用价值主要表现在抗炎、镇痛、抗菌、抗肿瘤等方面，民间常用于治疗中风、小儿惊风、虚寒胃痛、风湿性关节炎、跌打损伤、气管炎和某些皮肤病等疾病[19-20]。万象义等人将竹红菌甲素用于治疗外阴白色病变和疤痕疙瘩并取得了较好的疗效[1]，临床应用上已用来治疗皮肤病。随着研究的深入，发现竹红菌素还具有良好的光敏杀伤肿瘤细胞、抑制艾滋病病毒HIV-1等作用[21]。竹红菌素与抗肿瘤药物血卟啉衍生物相比，具有一定的优势，如易纯化、光化学动力高、从正常组织排除的速度快等[22]。HA和HB能通过光动力学作用，产生血管生成抑制因子促进人脑瘤细胞死亡[23]。HA能在光照下通过产生羟自由基损伤受体的DNA，促使其裂解，在无光照条件下HA也能诱导人黑色素肿瘤细胞（A375-S2）凋亡，同时诱导细胞周期蛋白CylinB1 mRNA表达增加并使细胞周期停滞在S期，其化学结构可能是诱导细胞凋亡的决定因素[24-25]。此外，药理实验显示竹红菌素具有镇痛、抗炎和抗菌等作用，但竹红菌素是脂溶性物质，其低水溶性和无特异组织分布制约了HA在光动力疗法中的应用，可采用物理包埋方式或化学修饰等方法进行改良，如用脂质体或环糊精等包埋剂包埋，提高其水溶性[26]。采用化学修饰的方式将其装载在转铁蛋白修饰的聚乳酸-羟基乙酸和羧甲基壳聚糖靶向纳米粒中（HA-CMC-PLGA NPs），饲喂老鼠，结果显示饲喂处理组小鼠的肠道和肿瘤部位积累了HA-CMC-PLGA NPs，同时肿瘤生长抑制率达到了63%[27]。采取上述的改良方式，不但提高了HA的利用效率，同时也使药物开发更有靶向性。

除上述应用在医学领域外，竹红菌素还可应用在农业、食品等领域。利用其光反应可开发新型、绿色、环保的光活化农药应用于农业生产中。徐德钦和夏更寿的研究表明，3种不同有机试剂的竹黄菌提取物对农作物中常见的病原菌均有不同程度的抑制作用，其中甲醇提取物的效果最好，对棉花枯萎病菌的抑制率可达74.78%，这可能与甲醇提取菌丝体中竹红菌素的效率有关[28]。殷红福等人[29]也有类似的研究结果，他们发现竹红菌甲素能明显的抑制多种植物病原菌，尤其是对松针褐斑、镰刀菌、苹果腐烂病菌、山核桃干腐病原菌等抑制率高达90%以上。此外，竹红菌甲素对众多的害虫（如桃蚜与黄粉虫等）均有杀灭效果。在光照条件下，HA对番茄灰霉菌的抑制作用显著高于黑暗条件，通过光反应typeⅠ和typeⅡ的机制起到抑菌的作用，其中typeⅡ为主要类型，产生的活性氧中单线态氧发挥的作用最大，是HA在抑制番茄灰霉菌菌丝生长的最关键因子[30]。另外，竹红菌素的着色力强、可溶于酒精和其他有机溶剂，色泽鲜红且富有保健功能，可作为一种脂溶性食品添加剂(食用色素）应用到食品加工业中。由此可见，竹红菌素在医药、农业、食品等领域有着巨大的研究价值和潜在开发应用价值。

4 产量优化方式

目前竹红菌素的天然产量较低，大量获得的生产方法主要有天然萃取法、化学合成法和微生物发酵法。其中萃取法生产因生物资源有限，生产周期过于漫长，无法满足研究和生产的需要；化学方法合成成本高，步骤较烦琐，同时会残留一些非目标的化学物质，纯度受到影响，无法实现大规模生产；而微生物发酵生产是目前公认的、比较容易实现大规模生产的一种方法[31-32]。

在进行微生物发酵HA生产前，筛选出合适的株系是首要考虑的因素。各个菌株间存在明显的遗传分化，来源不同、产地不同的竹黄菌株在形态以及竹红菌素产量方面存在着较大的差异[33]。本研究团队曾从野生竹黄子实体中分离得到82株内生真菌，发酵产物经TLC、HPLC鉴定获得能生产竹红菌素的ZHLS-03，并通过分子鉴定该菌株为竹黄菌[34]。Liang等人从短穗竹（B.densiflorum）中分离得到两个菌株，在竹红菌素产量上差异较大[35]。不同的菌株株系产生HA的效率不同，发现或创造新的菌株是提高HA产量的途径之一。从竹黄子座中新分离出未知菌丝可通过多次分离和转代进行培养，依据菌丝的形态、颜色初步进行判断，进一步对真菌内转录间隔区（ITS）进行扩增和测序，与已知菌株序列进行比对来确定新菌株的种属地位[36]。如从蛇足石杉（Huperzia serrata）中分离得到一株可产生石杉碱甲的内生真菌，属于竹黄菌属，被命名为Shiraiasp.Slf14，其菌丝和分生孢子形态与Shiraiasp.SUPER-H168相似，分子生物学分析结果 表 明Shiraiasp.Slf14与S.bambusicola、Shiraiasp.SUPER-H168的亲缘关系较远，极可能是为竹黄属的一个潜在新种[37-38]。新种质的发现可以丰富竹红菌素的来源，为其生产提供更多的天然资源和选择。

适宜的培养基质是提高竹红菌素的产量的重要因素之一。于建兴等利用单因素实验比较不同培养条件对竹黄菌生长和竹红菌素产量的影响，获得了最优的发酵条件，并发现竹红菌素的产生和竹黄菌的生长量有一定相关性，且碳氮比对竹红菌素的影响较为显著[39]。在液态发酵培养基中添加不同的金属离子会影响真菌Shiraiasp.Slf14株系合成苝醌类物质的数量，包括竹红菌素、痂囊腔菌素等，K+、Na+、Ca2+等离子的添加对合成有促进作用，然而Cu2+、Zn2+、Fe3+离子则极显著地抑制苝醌类物质的合成。钙离子通过诱导钙信号途径中3个关键钙感应蛋白和苝醌类化合物合成关键基因（PKS1、omef、hyd）的转录水平来调控苝醌类物质的合成[40]。Shiraiasp.SUPER-H168菌株在固体培养的不同时期外源添加淀粉酶和糖化酶可增加色素产量，进一步分离到24个淀粉酶，并且在不同碳源培养基下表达各异，同时过表达其中的amy365-1和amy130菌株在液体发酵第13天时色素最高产量达到71.85 mg·gds-1，是野生型的2.83倍[41]。在工厂化发酵中选择培养基的考虑因素除了产量外，还需考虑成本，在所获得的苝醌类物质产量相近的前提下，则可选择廉价碳源，为低成本规模化生产奠定基础[42-43]。

优化液体发酵过程中的温度、摇床转速、初始pH值、培养基等条件，可以提高竹黄菌的生物量，正如本团队的前期研究结果表明，在pH值为7.0、温度为30℃的发酵条件下竹黄菌丝生长较好且自由基清除率提高[43]。合适的条件下HA的产量也相应地提高，在优化竹黄ZH4菌株液体发酵条件后，HA产量从原来的103.51 mg/L提高到365.14 mg/L，增加了2.52倍，并且在暗培养下产生的色素量最大[43]。也有研究表明，弱光环境（小于600 lx）培养的竹黄菌无论是菌丝内还是胞外的HA都高于黑暗处理中[44]。光照尤其是蓝光下可以促进竹黄菌次生菌丝的生长，但色素的产量会减少。超声处理也影响竹黄菌的生长和生产HA的量，孙春晓对超声参数进行筛选并确定了最佳的超声处理条件，即在菌丝培养的第3天进行超声处理，处理3次，每次5 min，每次间隔12 h，不仅菌丝内HA的含量明显提高，同时也促进了HA向胞外的分泌，总含量达到247.67 mg/L，是对照组的3倍，另外大量活性氧积累，HA合成与释放相关基因（包括PKS、Mono、FAD、O-mef和MFS）表达水平上调[44]。外界不同因素影响着微生物发酵方式中竹红菌素的产量，从本质上来说是影响了真菌的生长状态，其中涉及到了不同酶的活性、不同基因的表达等调控的网络，相应的机理还有待于更系统性的研究。

5 结论与展望

综上所述，目前的竹红菌素大多是从竹黄中提取的，而我国的野生竹黄资源产量有限，野生竹黄采收期仅集中于每年的4—5月，随着竹红菌素的功能开发，天然的竹红菌素产量远远无法满足市场需求，因此竹红菌素的大量生产还须通过发酵的方式。在发酵过程中，菌株株系的选择、培养液的配方、培养条件等都会影响产量。随着分子生物学研究的发展和发酵技术的提高，更多的研究已深入到生物合成竹红菌素的机理机制、创新菌株的种质资源、提高利用率等方面并取得了一定的进展，但是仍有一些问题有待于解决和突破。在竹红菌素生物合成途径中的大多数关键酶和相应的基因敲除株系已经鉴定，但整个代谢通路仍不十分明确，并且其合成也必然受到其他通路的基因或者转录因子的影响进而形成一个复杂的代谢调控网络，另外对环境条件的响应和诱导机制也仍需进一步地研究。这些问题的阐明将使竹红菌素的生产更加地高效，将为实现竹红菌素的大规模工业化生产提供坚实的理论依据和技术支撑，也为合理保护、开发利用这一独特的医药资源提供新的方式和途径。