液体活检在肿瘤转移早期诊断中的应用*

王梦妍，娄加陶(上海胸科医院，上海交通大学附属胸科医院检验科，上海 200030)

肿瘤转移是影响患者预后最直接的危险因素[1]。传统的肿瘤转移检测金标准——组织活检作为一种侵入性的检查手段，对于年龄较大、病情较重的患者适用性差。而目前临床应用的许多影像学方法也存在不同程度的缺陷，如18F-NaF(一种带有药代动力学性能的PET成像的示踪剂)结合正电子发射计算机断层显像(positron emission tomography PET)/电子计算机断层扫描(computed tomograhy,CT)对监测肿瘤骨转移非常敏感，但18F-NaF会极大地影响患者的治疗效果[2]。PET试剂——氟化葡萄糖也常用于转移性前列腺癌，且具有较高的预后价值，但其主要用于晚期且很难评估其是否具有足够的敏感性。近年来，液体活检作为一种新型的诊断手段逐渐受到关注，其可以通过多种体液对肿瘤的转移进行非侵入性实时监测[3]。本文着重介绍不同液体活检指标在肿瘤转移中的应用进展及检测方法。

1 液体活检技术

“液体活检”的概念最早于2010年提出，由循环肿瘤细胞(circulating tumer cells，CTCs)作为乳腺癌活检的替代疗法，用于乳腺癌预后和治疗反应评估。肿瘤的液体活检是指以最小侵入性或非侵入性的方法取得患者的血液或其他液体样本(尿液、腹水、唾液、胸腔积液等)，对其中的肿瘤细胞或核酸等生物学标志物，如CTCs、循环肿瘤DNA(circulating tumer DNA,ctDNA)、循环肿瘤微小RNA(miRNA)、外泌体(exosome)、血小板(platlets)等[4]进行检测并获取相关疾病信息的技术。相比于组织活检这一肿瘤诊断传统金标准，液体活检具有很多优势，如非侵入性采样、均质化肿瘤异质性、操作方便、耗时短、重复性高、可实时监测肿瘤进展等。随着精准医学在肿瘤领域中的不断发展，液体活检的无创诊疗优势越来越受医疗业界关注，其临床应用扩展到肿瘤的诊断、治疗、转移判断等各个领域。

2 与肿瘤转移相关的液体活检标志物

2.1CTCs

2.1.1CTCs简介 在活检易引起高转移性风险的肿瘤患者中，CTCs检测有其优势，可用于判断肿瘤对靶向治疗的反应，如监测肿瘤表面的抗PD-1配体1(PD-L1)蛋白[5]。另外，通过对CTCs进行基因分析，尤其是转录组学分析，对于转移过程的研究非常重要。如采用RNA测序可检测胰腺癌鼠模型中非经典Wnt通路(尤其是Wnt2)中的肿瘤转移关键信号[6]。在CTCs的DNA甲基化分析中，目前已经发现CTCs具备一些与肿瘤-间质转化(EMT)相似的甲基化改变，如转移性去势性前列腺癌的CTCs中出现了EMT相关基因miR-200c/141和miR-200b/a/429 CpG岛甲基化水平显著升高(分别为33.7%和37.1%)，而转移性乳腺癌患者CTCs中，EMT相关基因miR-200c/141、miR-200b/a/429和CDH1 CpG岛甲基化水平分别升高了7.2%、20.8%和1.1%[7]。目前，CTCs多用于跟踪监测不同的突变型，特定的CTCs亚群还能决定肿瘤转移的器官倾向性[8]。同时，CTCs还能用于功能性研究，包括CTCs的产生、存活、与血液组分的相互作用以及CTCs进入血流后产生的远处损伤。因此，CTCs可为转移性肿瘤细胞的溯源提供有价值的信息。

2.1.2CTCs检测技术 目前已经有40多种方法用于分离CTCs，主要包括基于CTC生物学特性和基于其物理特性的分离方法两大类。基于生物学特性的方法包括生物标志物检测[如CELLSEARCH®circulating tumor cell (CTC) test]和生物标志物与微流控技术相结合(如Isoflux®FICOLL and EpCAM-based microfluidic device)。基于物理特性的方法包括根据CTC的大小、密度、离心力、导电性、变形性和光流控特性对CTC进行分离。其中强生公司的CELLSEARCH®circulating tumor cell (CTC) test(7900001)检测试剂盒是目前唯一被美国食品药品监督局(FDA)授权的CTC检测技术，已经应用于转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的临床诊断，该项技术通过抗体包被的磁珠识别肿瘤细胞表面的特异性蛋白，然后通过磁铁吸附磁珠达到分离CTCs的目的。此外，还有CTCs芯片以及用纳米毛刷上的抗体捕获等新型CTCs分离技术[9]。但富集CTCs的过程中很难保持其完整性，如流式细胞技术会破坏细胞团等，尽管已有分离CTCs细胞团的相关研究[10]，但在技术层面还不够完善。由于分离难度大，CTCs技术的临床应用仍然会受到许多限制，如尚未形成标准化的单个和成团的细胞富集技术，目前用于分离分析CTCs中DNA的技术不够灵敏，有的CTCs不表达上皮细胞黏附分子(EpCAM)，所以不能被以EpCAM为基础的方法捕获等[11]。综上，检测CTCs的技术仍处于发展阶段，这也是限制其应用的主要制约因素。

2.2ctDNA

2.2.1ctDNA简介 研究表明，肿瘤发生时，其DNA片段会持续汇入血流[12]。肿瘤细胞的转移能力主要来源于其形成早期，初级肿瘤细胞获得的突变等位基因不仅使细胞有了选择性复制的优势，还包括是否存在转移倾向。相比于后期肿瘤的遗传学改变，转移能力受最初肿瘤发生突变的等位基因的特性影响更大。

血流中多种与癌症相关的DNA片段长度均低于正常组织来源的DNA片段，且血液中可检出的高浓度短链DNA片段与肿瘤转移具有一定相关性，如黑色素瘤患者出现脑转移时，83%的患者血液中ctDNA浓度升高[13]。

2.2.2ctDNA检测技术 ctDNA检测是目前非侵入性肿瘤基因分型最简便的方法，它使更方便快捷的肿瘤基因分型技术的研发成为可能[14]。目前基于扩增阻滞突变系统(amplificaiton refractory mutation system, ARMS)的PCR技术在临床上的应用较为广泛，其操作简便，成本较低，常用于检测复发的热点突变和单核苷酸多态性。例如通过ARMS PCR检测BRAF突变基因，可监测甲状腺癌淋巴结转移[15]。但ARMS PCR技术每次仅能检测1个基因位点，且敏感性不高，仅约为0.1%～1%,限制了ARMS PCR的广泛应用。相比于ARMS PCR，数字PCR(dPCR)技术敏感性较高，能使血液中DNA检测的灵敏度精确至0.1%。Chang等[13]证实，使用微滴式数字PCR(ddPCR)技术检测ctDNA，可实现监测转移性黑色素细胞瘤的治疗效果。此外，另有研究证实，几种高度敏感的PCR技术，如BEAMing技术(数字PCR-流式技术)或PAP(焦磷酸激活的聚合作用)等均可检出单个ctDNA分子[16]。随着操作简化和费用降低，dPCR技术，尤其是ddPCR，有望得到更广泛的应用[17]。但dPCR的缺点是，所要寻找的异常基因的序列必须是已知的，而且是能同时检测的突变。更为精准的全基因组测序(whole genome squencing, WGS)技术的应用使ctDNA相关的液体活检得到发展，ctDNA得以从正常DNA中分离出来[18]。因此，无需提前假设突变基因的测序技术在临床应用中更受青睐[19]。ctDNA的等位基因突变比例较低，故而非常适用于靶向NGS(Targeted NGS),如基于杂交捕获的NGS和基于PCR的NGS等，目前已有通过NGS检测骨肉瘤进展和转移的研究[20]。但由于WGS费用较高，耗时较长，目前还不适用于常规的临床检测。

尽管以ctDNA为基础的液体活检在临床上已经得到了一定程度的应用，然而目前可用于肿瘤转移诊断的方法仍然十分有限。因此，ctDNA检测的推广仍需要进一步降低成本、简化实验操作并提高检测灵敏度。

2.3循环肿瘤miRNA

2.3.1miRNA简介 miRNA在肿瘤转移的多个过程中起到调节作用，如EMT、侵袭、血管生成和远处器官转移等[21]。研究表明，分泌型miRNA，尤其是外泌体中的miRNA，与肿瘤转移高度相关。如脑星形胶质细胞可以释放富含miR-19a的外泌体，使乳腺癌细胞中的抑癌基因PTEN沉默，从而促进其迁移[22]。

2.3.2miRNA检测技术 目前miRNA检测方法主要包括高通量基因芯片、RNA测序、PCR检测等，PCR检测又包括茎环法、poly(A)尾法和ddPCR法。由于miRNA的序列较短而且含量低，扩增困难，因此，用基因芯片检测miRNA的敏感性和特异性相对较低，一些miRNA序列仅有几个碱基有差异，这就容易导致假阳性升高。目前主要通过核苷酸类似物的引入解决这类问题。如用寡核苷酸提高捕获探针的熔解温度进而提高其检测灵敏度等。相比之下，RNA测序准确性较高，可以发现新的miRNA，即使检测样本中仅有小部分存在突变，也可以通过超深测序检测出来。但是miRNA测序的数据解释和分析较为复杂，费用较高，不同平台的检测结果也有较大差异。因此，可以参考基因组测序的方法，开发用于miRNA结果判读的软件，如miRDeep2等。PCR法中的茎环法和加尾法都是通过增加miRNA片段的长度提高检测灵敏度，这也是目前应用最广泛的检测方法。但由于这两种方法依然是相对定量的方法，目前又缺乏公认的内参基因，因此这些缺陷不利于其普及。dPCR是绝对定量的方法，不需要参考基因，即使检测低丰度样本也有较高的灵敏性,而且对PCR抑制剂的耐受性高。但这种方法成本较高，操作繁琐，机械化水平尚有待提高。

2.4外泌体

2.4.1外泌体简介 外泌体是含有功能性生物分子(蛋白质、脂质、DNA/RNA)的囊泡，可转运入受体细胞。研究表明，外泌体的某些成分，如蛋白质和miRNA，与肿瘤转移存在高度相关性。例如在胰腺癌患者中，含有磷脂酰肌醇聚糖-1(GPC-1)的外泌体浓度与肿瘤转移高度相关，预示着外泌体可以作为肿瘤转移早期检测的生物学标志物[23]。外泌体蛋白质组学研究发现，肿瘤发生时的整合素谱具有独特的表达特点。如外泌体蛋白组的变化能判断黑色素瘤患者发生非特异性远处转移的风险[24]；外泌体整合素α6β4和α6β1与肺转移有关，而αvβ5与肝转移有关。分别以α6β4和αvβ5为靶点，能降低外泌体的摄取，并分别降低肺转移和肝转移发生率[25]。

2.4.2外泌体检测技术 目前已经有可以通过外泌体检测肿瘤的商品化试剂，主要包括离心柱法和超速离心法两大类。离心柱法操作简单，但很多商品化试剂盒中的外泌体吸附材料的特异性不高，因此，收集的外泌体常包含直径更大的细胞外囊泡。而超速离心法分离的外泌体具有更高的纯度，因此，其应用更为广泛，但它需要能实现超高转速的离心设备。目前已有基于以上2种方法的改进技术，如府伟灵教授团队研发了基于捕获外泌体标志物CD63的抽提方法，其通过对临床样本进行检测，具有较好的应用潜能[26]。但由于外泌体之间CD63的表达水平存在差异，这种方法仍具有一定局限性。

2.5肿瘤血小板(TEP)

2.5.1TEP简介 1877年，Kanikarla-Marie等[27]发现了“富含特异性肿瘤成分的血栓”参与肿瘤细胞转移，随后其对巨核细胞、血小板、癌症之间相互作用的研究引出了TEP的概念。同时，血小板也有一定的吞噬摄取功能，例如，血小板能够摄取肿瘤来源的细胞因子和RNA，促进原位肿瘤的血管形成。

在肿瘤发生转移的过程中，CTCs普遍被血小板包被，血小板能与CTCs相互作用，使CTCs定植于血管壁，同时，黏附在CTCs上的血小板能抑制免疫系统对CTCs的识别，从而引起CTCs转移潜能增加[28]。另外，血小板引起的转移风险升高还可能与TGF-β和组织特异性有关[29]。

2.5.2TEP检测技术 目前对于TEP的检测，主要集中于计数、大小、相关标志物和RNA。研究表明，血小板计数和大小与癌症具有高度相关性，如血小板体积增大的胰腺癌患者生存率降低(P=0.000 5)[30]；同时，在多种癌症中，高血小板计数均与高死亡率相关，如恶性间皮瘤、妇产科肿瘤、肺癌、肾癌、胃癌、结直肠癌和乳腺癌等。有学者指出，TEP中的LncRNAs和EGFRvIII有助于转移性非小细胞肺癌的诊断[31]。TEP相关的标志物和RNA检测主要通过基因芯片和RNA测序。但目前的技术很难发现某种亚群的血小板对肿瘤更为敏感，因此，仍需要更深入的探索。

3 小结与展望

近年来，微转移细胞的研究和新一代测序技术发展迅猛，人们对于CTCs、miRNA、ctDNA等肿瘤相关生物学标志物的理解也日益加深。各种检测方法为检测肿瘤的生物学特性以及发生、发展过程提供了新的研究角度。液体活检的优势是方便、快捷、减少患者痛苦并能使临床医师密切监测患者对治疗的反应和及早发现肿瘤转移。从长远来看，液体活检可在患者出现症状之前，或在肿瘤转移早期发现播散的肿瘤细胞，在血流中循环的肿瘤DNA所包含的遗传信息可即时反映肿瘤发展的状况，甚至可以以此探索肿瘤来源。近年来，对液体活检的研究日益增多。为使液体活检在检测肿瘤转移和复发中发挥充分的作用，在临床应用中真正取代手术活检，还需要进一步探索提高其敏感性和精密度、降低成本的方法。