秋水仙素对华北型密刺黄瓜的诱变效应

刘美妍 周国彦 李晓丽 银珊珊 邢雨蒙 谢洋

摘    要：为探讨适宜华北型密刺黄瓜多倍体诱导技术体系，以黄瓜（2n=2x=14）种子期、萌动种子期和子叶期为试材进行不同浓度秋水仙素处理，通过形态学、细胞学、流式细胞术鉴定，成功获得三倍体（3x）、四倍体（4x）和混倍体（2x+4x/8x+16x）植株，并对二倍体和四倍体黄瓜进行农艺性状和营养品质分析。结果表明，0.4%秋水仙素处理黄瓜萌动种子4 h诱导四倍体的效果最佳，DNA诱变率为18%;0.2%秋水仙素处理黄瓜种子2 h诱导三倍体和混倍体效果最佳，DNA诱变率为15%;四倍体较二倍体节间变短，叶色油亮，叶面积、雌花器官增大，花粉粒呈四孔，染色体、DNA含量加倍，果形指数减小幅度达35.66%，可溶性糖含量和硬度增幅分别为91.74%和34.73%。研究结果为黄瓜多倍体种质创制奠定了技术基础。

关键词：黄瓜;秋水仙素;多倍体;流式细胞术;果实品质

中图分类号：S635.1 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）11-010-07

Mutagenesis effect of colchicine on north China cucumber with dense thorny

LIU Meiyan1， ZHOU Guoyan1， LI Xiaoli1，2， YIN Shanshan1， XING Yumeng1， XIE Yang1，2

（1. College of Horticulture Science and Technology， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066004， Hebei， China; 2. Hebei Key Laboratory of Horticultural Germplasm Excavation and Innovative Utilization， Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066004， Hebei， China）

Abstract： In order to explore the technology suitable for the induction of autotetraploid of north China cucumber with dense thorny， the cucumber （2n=2x=14） was treated with colchicine at different concentrations at seed stage， germination stage and cotyledon stage. The triploid （3x）， tetraploid （4x） and miploid （2x +4x/ 8x+16x） plants were successfully obtained by morphological， cytological and flow cytometry. The agronomic traits and nutritional quality of diploid and autotetraploid cucumbers were identified. The results showed that 0.4% colchicine treatment for 4h had the best effect on inducing autetraploid， and the induction rate was 18%， 0.2% colchicine treatment for 2 h had the best effect on inducing triploid and misoploid seeds， and the induction rate was 15%. Compared with diploid， autotetraploid showed shorter internode， grey-green leaf color， increased leaf area， female flower organs and stomata， four-hole pollen grains， double chromosome and DNA content， fruit shape index decreased by 35.66%， soluble sugar content and hardness increased by 91.74% and 34.73%， respectively. This study laid a technical foundation for the creation of cucumber polyploid germplasm.

Key words： Cucumber; Colchicine; Polyploid; Flow cytometry; Fruit quality

黃瓜（Cucumis sativus L.，CC，2n=2x=14），又名青瓜、胡瓜，属于葫芦科黄瓜属，是世界十大蔬菜之一[1]。黄瓜营养丰富，含维生素C、蛋白质、糖类和人体必需的有益矿物质，具食疗价值，深受人们喜爱，在我国设施蔬菜生产和周年供应中占有重要地位[2]。因黄瓜栽培种的遗传基础狭窄，不仅限制了其产量和品质的进一步改良，而且使黄瓜对逆境环境的适应能力减弱[3-4]。

多倍体是大多数陆地植物谱系中存在超过2套完整染色体组的生物体，是促进生物进化和遗传多样性的重要力量[5]。多倍体植物因其具有较强可塑性，即染色体多倍化后拓宽了物种的遗传变异范围及增强了对外界胁迫的缓冲能力，有利于创建优质、高产的新品种和增强植物的抗病、抗逆能力[6]。迄今为止，多倍体育种已广泛应用在西瓜、甜瓜、黄瓜、番茄、马铃薯、白菜、萝卜等蔬菜作物的育种工作中。例如，利用多倍体的巨大性培育出的同源四倍体萝卜小顶红，与其二倍体相比，气孔、花粉粒、花器官、叶片和肉质根等都增大，同时表现出高可溶性糖、可溶性蛋白和维生素C等优良品质[7];利用多倍体低育性培育出优质高产无籽西瓜津蜜55、雪峰新二号等新品种[8-9];利用多倍体抗病、抗逆性强等特点，培育出抗病毒病、软腐病、霜霉病和抗逆性强四倍体白菜品种多维462[10];利用染色体多倍化可以克服远缘杂交障碍培育新品种。

蔬菜多倍体种质创制是培育优质高产蔬菜新品种的一个重要途径，为蔬菜品质性状遗传改良与种质创新提供了一个新思路[11]。目前黄瓜多倍体材料陆续被创制出来，如利用秋水仙素诱导子叶期幼苗、萌动种子或干种子分别获得欧洲温室型、华北型无毛黄瓜同源四倍体等[12-15]。但关于不同誘导技术体系的诱导效应的比较研究鲜有报道。鉴于此，笔者以津研四号黄瓜为试材，采用不同浓度秋水仙素对干种子、萌动种子和子叶期幼苗进行诱导处理，通过形态学、细胞学、流式细胞术鉴定，探究不同诱导体系的多倍化效应，并对二、四倍体黄瓜进行农艺性状和营养品质鉴定。以期筛选最优的多倍体诱导与鉴定体系，为丰富黄瓜种质资源提供技术理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2019年8—12月在河北科技师范学院园艺中心实验室和园艺园林试验站1号日光温室中进行。供试材料为津研四号黄瓜（2n=2x=14），购于山东鲁蔬种业有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 诱导剂配制 0.2%、0.3%和0.4%秋水仙素溶液配制：分别称取0.2、0.3、0.4 g秋水仙素粉末于小烧杯中，加入100 μL 95%酒精助溶，再加50 mL蒸馏水溶解后倒入100 mL容量瓶中定容。完成后装入棕色瓶，整个配制过程避光，4 ℃保存备用。

1.2.2 多倍体诱导 子叶期诱导、种子期诱导和萌动种子期诱导的样本量均为50粒种子，以蒸馏水处理为对照。子叶生长点诱导（T1）：经温汤浸种与催芽后的种子播种于50孔穴盘内，于日光温室中育苗。待子叶展平后，将棉球置于生长点，用胶头滴管吸取0.3%秋水仙素溶液，滴于棉球上，完全浸湿棉球。每日9：00和17：00处理，共计6次。萌动种子诱导（T2）：50粒种子温汤浸种后种子放置28 ℃恒温箱中催芽，待胚根长度至0.3～0.5 cm，用0.4%秋水仙素处理，蒸馏水作对照，于摇床（震荡速度为50 r·min-1）上避光处理2 h，处理后用清水冲洗3次，播于50孔穴盘。吸胀种子诱导（T3）：种子浸种2 h后，放入50 mL移液管中，加入3.5 mL的0.2%秋水仙素溶液，避光处理2 h，处理完毕用清水冲洗3次，播于50孔穴盘。相关指标测定公式为：致死率/%=死亡的株数/总株数×100，诱变率/%=产生变异的株数/总株数×100。

1.2.3 流式细胞仪鉴定 取对照株（2x）与诱变株黄瓜叶片0.2 g置于荧光染料DAPI缓冲液内，用手术刀切碎，悬浮液经20 μmol·L-1尼龙网过滤，调整细胞核密度至 10万～30万个·mL-1。用流式细胞仪检测每个细胞和荧光信号强度，并经仪器自动分析。选择通道，上机5000个颗粒，进行分析[16]。

1.2.4 形态学观察 于苗期和结果期分别观察对照与诱变株的形态特征，调查苗期子叶、节间、分枝性、叶色、叶形、花器官、果实外观品质性状等指标，其测定方法参考黄瓜种质资源描述规范[17]。

1.2.5 细胞学观察 花粉粒观察：于晴天9：00—10：00选取长势旺盛的对照与诱变株（当代）的开放花朵，在载玻片中央滴1滴清水，用手拨动花朵，将花粉散落于清水中，轻盖盖玻片，置于显微镜下观察[18-19]。染色体观察：于8：00取未开放雄花，用镊子取出花药，散落放入载玻片上，滴加品红染色液，烤片再压片，置于显微镜下观察[20]。

1.2.6 果实营养品质测定 采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[21]，采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量[22]，采用2-6二氯酚靛酚滴定法测定维生素C含量[23]，采用数字折光仪测定可溶性固形物含量，采用果实硬度显示计测定果实硬度。

1.2.7 数据统计与分析 利用Microsoft Excel 2010和DPS 9.01软件进行黄瓜形态指标、诱变指标、果实营养品质指标等相关数据的录入及统计学分析。

2 结果与分析

2.1 秋水仙素对黄瓜多倍体诱导的效果

对比黄瓜多倍体诱导的3种秋水仙素处理方法发现，形态变异率均在40%以上，0.4%秋水仙素处理萌动种子4 h（T2）的DNA诱变率最高，高达18%，但同时致死率也最高，为28%。0.3%秋水仙素处理子叶期黄瓜生长点6次（T1）的诱导效果，其致死率最低，为22%，但DNA诱变率也最低，为9%。0.2%秋水仙素处理种子2 h（T3）的致死率和DNA诱变率均居中，分别为24%和15%（表1）。

通过对二倍体对照和诱变株的苗期（日历苗龄相同）观察，发现3种秋水仙素诱导方式下，幼苗的生长速度明显不同，速度从大到小依次为子叶期T1、种子期T3和萌动种子期T2处理;叶形、叶色均发生改变，主要表现在诱变株叶面积增大、叶色变深、叶片加厚、叶缘呈锯齿状等方面（图1）。

为了准确鉴定出诱变株的倍性，分别提取对照和诱变株的基因组DNA，利用流式细胞仪进行植株的倍性分析与鉴定。研究发现，诱变株中存在未发生加倍的二倍体（2x）和发生倍性变异的三倍体（3x）、四倍体（4x）、二倍体和四倍体混倍体（2x +4x）、八倍体和十六倍体混倍体（8x+16x）等（图2）。由表1可知，子叶生长点处理的DNA诱变率为9%，萌动种子处理的DNA诱变率为18%;吸胀种子处理的DNA诱变率为15%，诱导三倍体（3x）、四倍体（4x）、混倍体（2x +4x）、混倍体（8x +16x）概率分别为3.5%、2.5%、2.8%和6.2%（流式细胞术测定数据的统计结果）。

2.2 黄瓜二倍体与四倍体形态学比较

对秋水仙素处理前后植株的营养器官进行形态学的观察和测量，发现四倍体植株较二倍体植株（相同日历苗龄）较矮壮，主茎较粗，差异显著。其中茎横径增幅达29.79%，节间变短，降幅达12.95%;叶面积大，叶色油亮，叶绿素含量高且增幅达34.07%（表2，图3）。

四倍体黄瓜与二倍体相比，雌花花瓣长、花瓣宽、子房宽均显著增大，增幅分别为30.63%、42.24%、25.00%，花冠褶皱程度高;但雄花花瓣长、花瓣宽分别显著减小29.91%、6.42%，雌花子房长极显著减小33.91%（图4，表3）。

四倍体黄瓜与二倍体相比，单瓜質量显著增大，瓜长显著减小6.23%，瓜横径极显著增大51.96%，果形指数极显著减小，瓜把长显著减小20.70%，瓜把横径显著增大8.37%（图4，表4）。

2.3 黄瓜二倍体与四倍体细胞学鉴定

利用花粉母细胞制片观察发现，四倍体（4x）花粉粒存在畸形现象且有4个萌发孔，而二倍体黄瓜花粉粒大小一致性高，有3个萌发孔（图5-a）。四倍体（4x）较二倍体（2x）染色体个数加倍，由原来的14条染色体加倍为28条染色体（图5-b）。

2.4 黄瓜二倍体与四倍体果实营养品质比较

四倍体较二倍体黄瓜的维生素C含量、可溶性固形物含量、果实硬度均显著增高，可溶性糖含量极显著增高，其中可溶性糖含量、硬度、维生素C含量增幅分别达91.74%、34.73%和11.10%（表5）。四倍体黄瓜可溶性蛋白含量较二倍体显著下降26.16%（表5）。

3 讨论与结论

多倍体诱导是创制新种质的重要途径之一[20]。目前人工诱导植物多倍体的方法有生物诱导、物理诱导和化学诱导，其中化学诱导主要是利用化学试剂如秋水仙素、植物激素及其他植物碱等人工诱导多倍体。化学诱导又分为体外诱导和体内诱导，体内诱导植物多倍体一般处理植物细胞分裂较旺盛的部位，常用方法包括浸种、涂抹生长点、浸芽等[24]。陈劲枫等[12]利用0.4%秋水仙素处理华北型黄瓜干种子和萌动种子4 h，获得黄瓜四倍体植株，加倍率26.7%;武娅歌等[13]利用0.3%秋水仙素处理欧洲温室型黄瓜子叶期生长点5次，获得黄瓜四倍体植株和非整倍体植株，诱导率4%;刘永月等[14]利用0.4%秋水仙素和2%二甲基亚砜混合溶液处理萌动种子4 h，获得无毛黄瓜四倍体，诱导率14%;鄢郁霖等[15]利用0.8%秋水仙素处理干种子和萌动种子4 h，获得了露地型黄瓜四倍体，诱导率分别为1.81%和7.27%。笔者以津研四号为试材，综合前人最佳的多倍体优化体系，以种子期、萌动种子期和子叶期材料进行不同浓度秋水仙素处理，通过形态学与DNA含量鉴定，成功获得了四倍体材料。通过比较3种诱导体系发现，0.4%秋水仙素处理萌动种子4 h诱导四倍体的效果最佳（诱导率18%），0.2%秋水仙素处理种子2 h诱导三倍体和混倍体效果最佳（诱导率15%），而0.3%秋水仙素处理子叶期生长点6次（诱导率9%）效果低于前2种方式。以上结果与前人研究基本一致，0.4%秋水仙素处理萌动种子4 h可作为黄瓜四倍体诱导的最优技术体系[12-15]。

基因剂量效应使多倍体细胞体积、植物器官增大，细胞内含物增多，往往表现出巨大性、高抗性，因而多倍体被认为是植物进化的加速器[25-26]。笔者诱导的四倍体植株在形态学特征上与二倍体相比差异明显，四倍体较二倍体植株生长迟缓，但茎横径、叶宽、叶面积、雌花和果形指数均增大，节间长度、雄花、果实长度均减小。四倍体与二倍体细胞学特征比较发现，四倍体花粉粒较二倍体的体积增大，可能原因是四倍体有4个萌发孔，而二倍体仅有3个萌发孔。与前人报道相比，除雄花减小外，其他各指标变化趋势相一致[12-15]。

在果实外观品质方面，四倍体较二倍体最显著的特征是果实变短变粗即果形指数减小，瓜把缩短且果实硬度变大;在果实营养品质方面，四倍体较二倍体可溶性糖含量、维生素C含量、可溶性固形物含量显著增加。关于黄瓜多倍体营养品质方面的报道很少，但是与其他蔬菜如萝卜、白菜、甜瓜等多倍体相比较是相一致的，黄瓜多倍体的营养品质变化也是向更有利于物种进化的方向变异[27-28]。本研究为黄瓜多倍体育种提供了技术支持，为双子叶植物多倍体育种提供了参考。

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