KLF4通过Wnt信号通路抑制甲状腺癌细胞EMT及侵袭迁移的实验研究

陈 翔，刘利敏，张 琰，陈 勇，屈 悦，徐 宙，陆宝华

(上海市宝山区中西医结合医院甲状腺外科 201999)

甲状腺癌的发生、发展和转移是一个复杂的过程，涉及许多因素。目前关于上皮间质转化(EMT)在甲状腺癌中的研究表明，EMT参与了甲状腺癌的进展[1-2]。EMT过程涉及转录因子、生长因子、信号级联、表观遗传调控和肿瘤微环境等组成的复杂网络。据文献报道，Kruppel样因子4(KLF4)可以通过上调上皮基因表达和下调间质基因表达来调节EMT的进程[3-4]。而在恶性肿瘤中调控这些关键性分子的表达，能促进或抑制细胞的侵袭和转移[5-6]。本课题组前期报道了KLF4在甲状腺癌中的表达及对肿瘤侵袭转移的影响[7]。本研究从Wnt/β-catenin信号通路角度探讨KLF4调节甲状腺癌细胞侵袭和迁移的分子机制，以阐释对KLF4在甲状腺癌侵袭迁移过程的认识。

1 材料与方法

1.1 材料

细胞：甲状腺乳头状癌细胞株KTC1购自武汉普罗赛尔公司(CL-0649)。主要试剂及器材：DMEM培养基购自杭州四季青公司；RNA提取试剂TRIzol购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(15596-026)；逆转录试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司(R101-01/02)；PCR引物等由上海擎科生物公司合成；二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自上海碧云天公司(P0010)；一抗β-catenin，基质金属蛋白酶7(MMP7)和KLF4均为兔源性单抗购自美国Abcam公司；兔源性多抗上皮型钙黏蛋白(E-cad)和神经型钙黏蛋白(N-cad)分别购自美国Affinity公司和武汉三鹰生物公司；定量PCR仪购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(Quant Studio 6)；分光光度计购自杭州奥盛仪器有限公司(Nano-100)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养、转染及分组

体外细胞培养密度约为80%，对数生长期消化细胞，接种至培养板，每孔密度约5×105个，培养达80%融合度。慢病毒载体的组装和测试等均由上海GenePharma公司承担。KLF4-siRNA及阴性对照siRNA引物序列为见表1。相关转染操作参阅LipofectamineTM2000说明。将KTC1细胞分成5组：(1)空白对照组，不作任何处理；(2)阴性对照组，转染LipofectamineTM2000；(3)KLF4过表达组，转染LipofectamineTM2000+KLF4；(4)siRNA-NC组，转染LipofectamineTM2000+NC-siRNA；(5)KLF4-siRNA组，转染LipofectamineTM2000+KLF4-siRNA。取5 μL脂质体融入培养液中混匀，在26 ℃下放置20 min。向每个孔中加入200 μL混合溶液，并转移到37 ℃的培养箱中48 h，获得的细胞RNA或蛋白质留待进一步检测。

1.2.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测EMT过程中Wnt通路相关基因的表达水平

从对数生长期细胞中提取总RNA后将其逆转录为cDNA，并以cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系和反应条件见说明书。E-cad、N-cad、MMP7引物序列见表1，GAPDH为内参，绘制溶解曲线，以计算公式2-ΔΔCt算出EMT相关基因mRNA的表达水平。

表1 引物序列(5′-3′)

1.2.3Western blot检测EMT过程中Wnt通路相关蛋白的表达

提取对数生长期细胞的总蛋白并检测蛋白水平，变性后加样，每孔40 μg，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，重复3次。转膜后添加一抗，然后在冰箱中-4 ℃环境下过夜。24 h后加二抗稀释，37 ℃孵育2 h，洗膜后增强化学发光法(ECL)显像并保存图像，BandScan计算图像的灰度值。

1.2.4免疫荧光检测细胞中KLF4和β-catenin的定位

制作细胞爬片并固定、穿孔，加入正常山羊血清并静置20 min，添加一抗：兔抗KLF4(工作浓度为1∶50)，小鼠抗β-catenin(工作浓度5 μg/mL)，放入4 ℃湿盒中静置24 h。磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后加第二抗体，山羊抗兔IgG(Cy3标记)和山羊抗小鼠IgG[异硫氰酸荧光素(FITC)标记]，工作浓度均为1∶100。添加荧光染色剂后在避光条件下进行核染，最后在荧光显微镜下分析和收集图像。

1.2.5蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)检测KLF4和β-catenin间的蛋白质相互作用

将KTC1细胞分为3组：KLF4处理组，予以2.0 mmol/L 二硫苏糖醇(DTT)处理24 h；input阳性对照组，加入等体积的裂解液处理；IgG阴性对照组，加入等体积的IgG处理。提取并定量细胞总蛋白500 μg，加入蛋白-A/G琼脂糖珠，静置1 h时。回收上清液，添加兔抗人β-catenin或KLF4单抗(工作浓度均为1∶200)，4 ℃孵育24 h。第2天，将蛋白-G琼脂糖珠加入并混合4 h。用低强度放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液洗涤并收集琼脂糖珠；加入裂解液和蛋白上样溶液，在99 ℃加热10 min；离心后保留上清液，除去琼脂糖珠，余下步骤与常规Western blot相同。

1.2.6免疫组织化学(IHC)检测甲状腺癌组织及癌旁组织中KLF4蛋白表达

选取本院2019年7-12月甲状腺癌标本45份，均为常规行单侧腺叶+峡部切除或双侧全切+中央区淋巴结清扫。采用SP法检测KLF4的表达水平，第一抗体购自武汉博士德生物有限公司，工作浓度为1∶150。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 KLF4和β-catenin在KTC1细胞质中的定位

免疫荧光检测结果显示，KLF4显示绿色荧光，β-catenin显示红色荧光，图像叠加后KLF4和β-catenin在部分KTC1细胞质中同时表达，KLF4和β-catenin有部分共定位，见图1。

2.2 各组KTC1细胞EMT过程中Wnt信号通路中相关基因和蛋白表达水平比较

qRT-PCR结果显示，KLF4过表达组E-cad mRNA表达明显高于其他组(P<0.05)，N-cad 和MMP7 mRNA表达明显低于其他组(P<0.05)；沉默干扰KLF4后，与其他组相比，KLF4-siRNA组中的E-cad mRNA明显降低(P<0.05)，N-cad和MMP7 mRNA明显升高(P<0.05)，见表2。Western blot结果显示，KLF4过表达组中E-cad表达较其他组明显升高(P<0.05)，而N-cad、MMP7表达则明显低于其他组(P<0.05)，显示KLF4过表达可以逆转EMT；当沉默干扰KLF4时，上皮标志物减少，间质标志物增加，见表3、图2。

表2 各组KTC1细胞Wnt通路相关基因表达水平比较

表3 各组KTC1细胞Wnt通路相关蛋白表达水平比较

图1 各组细胞中KLF4和β-catenin蛋白表达

1:空白对照组;2:阴性对照组;3:KLF4过表达组;4:siRNA-NC组;5:KLF4-siRNA组。

2.3 各组KTC1细胞的迁移和侵袭能力比较

Transwell结果显示，KLF4过表达组侵袭和迁移细胞数量最低，而KLF4-siRNA组中侵袭和迁移细胞数量最高(P<0.05)，见表4、图3。

2.4 KLF4和β-catenin蛋白间的相互作用

Co-IP结果显示，将KLF4抗体或β-catenin抗体进行正向或反向的Co-IP，均可以检测出KLF4与β-catenin间的相互作用，见图4。

2.5 KLF4在甲状腺癌中的表达情况

KLF4在甲状腺癌及癌旁组织中的阳性表达率分别为24.44%(11/45)和71.11%(32/45)，二者比较差异有统计学意义(χ2=19.639，P<0.001)。45份标本中，伴淋巴结转移18份中KLF4表达4份阳性，而不伴淋巴结转移27份中KLF4表达15份阳性，二者比较差异有统计学意义(22.22%vs.55.56%,χ2=4.919，P=0.027)。

表4 各组KTC1细胞迁移和侵袭细胞数比较

图3 各组KTC1细胞迁移、侵袭情况

图4 KTC1细胞中KLF4和β-catenin的相互作用

3 讨 论

甲状腺癌总体预后良好，若伴有腺外侵犯和淋巴转移等重要独立预后因素，预后明显不佳[8-9]。EMT在肿瘤的侵袭、血行播散和微转移形成等过程中扮演重要角色[10]。本课题组先前的研究[7]及本次临床标本检测均表明，KLF4在甲状腺癌中低表达，并起着抑癌基因的作用。在本研究中，由于KLF4过表达处理癌细胞后，结果上皮标志物增加，间质标志物减少，并抑制了EMT过程；沉默KLF4表达后，结果却相反，从而加速了EMT的过程。通过临床标本检测发现转移淋巴结KLF4阳性率低，未转移淋巴结阳性率高，可能提示KLF4表达缺失可能促进癌细胞淋巴结转移。表明甲状腺癌中KLF4水平的升高有望在逆转EMT中发挥作用，KLF4可能通过参与甲状腺癌的EMT过程而发挥重要作用。

有研究表明，多个信号通路与EMT相关[11-13]。据文献报道，Wnt/β-catenin信号通路与甲状腺癌细胞的EMT过程密切相关，并起重要作用[14]。KLF4作为一种广泛存在于人体各种组织中的转录因子，可以参与多种细胞生物学行为的调节，并在肿瘤的抑制或发展中发挥作用[15-16]，这些差异可能取决于不同的条件和细胞类型。本研究通过Co-IP证实了KLF4下游的信号分子是β-catenin；免疫荧光显示KLF4和β-catenin可以共表达。而且KLF4的过表达可降低β-catenin和N-cad蛋白的表达，增加E-cad的表达，并减弱肿瘤细胞的侵袭和迁移。表明细胞中过量的E-cad可以与游离的β-catenin结合形成结合物，这在一定程度上提高了细胞间的黏附性，而减轻了癌细胞的侵袭性[17]。体外实验表明，癌细胞中β-catenin基因的缺失会削弱细胞的侵袭性[18]，推测原因是低水平的β-catenin不能与淋巴细胞增强因子/T细胞因子(TCF/LEF)转录因子有效结合。因此，本研究认为在KTC1细胞过表达KLF4之后，β-catenin表达降低，从而阻止β-catenin与TCF/LEF结合并有效地防止下游靶基因被激活。

与此同时，当KLF4在癌细胞中过表达后，MMP7低表达，这削弱了细胞迁移和侵袭的能力；而将KLF4干扰后，MMP7表达上调，肿瘤的侵袭和迁移能力得到增强。MMP7与恶性肿瘤的侵袭性生长和远处转移有关。VOKA等[19]发现，MMP7是转移性大肠癌敏感性较好的生物标志物，外周血中MMP7的水平与肝转移程度和生存预后密切相关。YUAN等[20]发现，人舌鳞状细胞癌组织中MMP7的表达明显高于非肿瘤组织，且与淋巴结转移有关；细胞试验表明MMP7能提高癌细胞的侵袭能力。本实验中，KLF4过表达可以降低细胞内β-catenin和MMP7蛋白的表达，而KLF4干扰敲除后可促进β-catenin和MMP7的上调，表明KLF4可通过Wnt信号通路调节相关下游靶基因的表达，从而影响了肿瘤的侵袭和迁移能力。

综上所述，本研究认为，在甲状腺癌中，KLF4过表达可以抑制EMT过程，影响肿瘤的侵袭和迁移，并且该过程的实现取决于Wnt信号传导通路的参与和调节。KLF4和甲状腺癌间的关系表明，KLF4可能是有前途的预后标志物，也是甲状腺癌的潜在治疗靶标。