循环microRNA作为肝细胞癌标志物的研究现状

谢惠君， Rashed Nasot， 宁 勇， 高 川

湖北中医药大学 检验学院， 武汉 430065

1 肝细胞癌(HCC)的发生和发展伴随着microRNA(miRNA)的异常表达

HCC是最主要的原发性肝癌，也是致死率最高的癌症之一, 仅美国在2020年就预期约有30 000人死于HCC[1]。当前对HCC的临床诊断除了依靠有限的血清标志物，例如甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体以及异常凝血酶原之外，还需要比较先进的影像学技术的支持[2]。而大多数HCC患者被确诊时已经处于晚期，可供选择的治疗手段有限[3]。更加全面的了解有关HCC发生的分子机制以开发出可用于早期诊断的方法是当前迫切的需求。

miRNA是一类内源性、不编码蛋白质的小RNA。成熟的miRNA能引导RNA诱导沉默复合体作用于靶标mRNA的3′-非翻译区，继而影响其稳定性和翻译成蛋白质的效率，最终“沉默”靶基因的表达[4]。miRNA对靶标的识别是通过位于其5′- 端、长度仅为6～8个核苷酸的种子(seed)序列，这使得单一miRNA能作用于多个靶标，而已发现的超过2000个人类miRNAs将能广泛的调节基因表达[5]。与mRNA不同，miRNA在循环血中非常稳定，这是因为分泌到胞外的miRNA大多都包裹在外泌体、微囊泡之内或者处于与蛋白质(AGO2，高密度脂蛋白等)结合的复合体形式从而能抵抗RNase的降解[6-7]。miRNA的这些性质使它们有希望成为用于临床检验的生物标志物。

肝脏维持正常的生理功能需要miRNA。在胚胎期敲除了肝细胞中的Dicer1从而整体扰乱miRNA成熟过程的小鼠在2～4月龄时出现了严重的肝损伤[8]。在成年小鼠其肝细胞中敲除Dicer1的初期也会产生类似的表现型，部分能长期存活的小鼠其肝组织主要由侥幸逃过Dicer1敲除的肝细胞构成，它们中大多数在1年内发展成源自残留的Dicer1-/-肝细胞的HCC[9]。miR-122是肝脏中含量最丰富的miRNA[10]，具有维持肝脏自稳(homeostasis)的作用[11]。利用反义核苷酸部分阻断内源性miR-122会显著降低小鼠体内甘油三酯和胆固醇的水平[12]，强制过表达miR-122则能缓解模型小鼠肝脏中因输血性铁过剩引发的炎症反应[13]。

miRNA广泛参与HCC的发生和发展[14]。通过比较源自临床HCC样本的癌和癌旁组织中的miRNA表达谱已经发现了一系列差异表达的miRNAs，包括在HCC中常常低表达的miR-122、miR-199a、miR-133b、miR-200等以及在HCC中高表达的miR-18、miR-21、miR-221和miR-769等[15-20]。一般而言，在HCC中异常低表达的miRNA有抑癌作用，例如：miR-122可以通过调节M2型丙酮酸激酶来影响HCC细胞中的葡萄糖代谢[21]，亦可通过调节cyclin G1而抑制HCC细胞的周期[22]，还可以通过调节转化蛋白RhoA来阻碍HCC的侵袭和转移[23]。miR-199a和miR-122一样在HCC细胞代谢葡萄糖的过程中起着重要的作用。过表达miR-199a-5p可以降低M2型丙酮酸激酶以及HK2的表达从而抑制HCC细胞的生长[24-25]，而miR-199a-3p则可抑制对HCC增殖起促进作用的PAK4/Raf/MEK/ERK、mTOR以及c-MET通路[26-27]。与miR-122及miR-199a相比，miR-133b在正常肝细胞中的表达不算丰富，而在HCC临床样本中的表达普遍更低[18,28]。在HCC细胞系中的研究表明miR-133b能通过调低SH3蛋白1和SF3B4来抑制癌细胞的生长和侵袭。在HCC中异常高表达的miRNA往往有促癌作用。例如，miR-221在包括HCC在内的许多癌组织中都被发现表达上调[29]，它调节的靶标有许多是涉及癌细胞增殖和侵袭的关键基因，包括CDNN1B(p27)、CDKN1C(p57)、mTOR以及抑癌基因PTEN和TIMP3等[29-31]。最近的研究[32]还发现miR-221可靶向调节Caspase-3来抑制细胞凋亡，它的高表达在HCC动物模型和临床样本中都与癌细胞对Sorafennib的耐药性呈正相关。无论是抑癌还是促癌的miRNA都有可能成为HCC的治疗靶点和临床诊断标志物。

2 循环miRNA应用于HCC临床检验和诊断所面临的问题

鉴于miRNA在循环血中的稳定性以及在功能上与HCC之间存在的相关性，许多团队尝试对循环miRNA进行深度测序以探索它们作为HCC诊断标志物的潜能。Li等[33]于2010年发现在HBV感染阳性的患者中可以通过联合检测miR-25、miR-375和let-7f来区分HCC患者和对照者(特异度为96%，敏感度为100%)；随后，Zhou等[34]所进行的类似研究中发现联合检测miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a和miR-801可以用来诊断HCC。Lin等[35]提出了使用由miR-29a/c、miR-133a、miR-143、miR-145、miR-192和miR-505等7个miRNAs组成的Cmi(miRNA classifier)用于检测HCC，并发现其准确性优于单独依赖肿瘤标志物甲胎蛋白。还有一些学者联合使用了循环miRNA和现有的HCC临床诊断标志物。例如：El-Abd等[36]发现血清miR-199a和miR-16水平与HCC的肿瘤结节大小和数量等指标显著相关，联合检测血清miR-16与甲胎蛋白可以更好地区分慢性HCV相关的HCC(特异度为87.5%，敏感度为85%)。Nomair等[37]尝试联合检测血清中的miRNA-224与甲胎蛋白来诊断HCC，也得到了类似的结果。这些研究为后续寻找新的用于检测HCC的临床标志物奠定了基础，但是必须认识到要在临床实践中应用miRNA作为HCC的标志物还有很多问题亟待解决。

对临床血样中的miRNA测序后的组学数据进行统计学分析属于相关性研究而非功能性研究，从中得到的可能作为HCC标志物的miRNA与HCC的生物学关系需要明确，这一工作困难重重。首先，要确定血样miRNA的组织来源非常困难。不同于mRNA，miRNA的表达鲜有组织特异性，而在正常肝细胞中高表达的miRNA仅有miR-122、miR-92和miR-199a等少数几种，其他绝大多数miRNAs都处于极低的基础表达状态(<10 TPM, transcripts per million)[27,38]。通过取样的方式确定血样中过表达的miRNA的组织来源在临床上很难实现。此外，即便确定了miRNA的组织来源也并不意味着找到了研究对象。许多成簇(cluster)表达的miRNA由共同的初级转录本(pri-miRNA)编码，进行功能研究时，需要考虑这些簇成员的选择性胞外输出特性和在成熟过程当中以及对靶标基因调节方面的协同作用[39-40]。而研究由mirtron编码的miRNA时，还需要顾及这些miRNAs与包含它们的基因在功能上可能形成的反馈回路[41-42]。此外，被其他组织释放到胞外的miRNA经过血液循环运送到肝脏从而“远程”发挥作用的可能性也不能排除[43-44]。综合这些考量，鉴定循环血中发现的HCC相关miRNA的功能任重而道远。

使用循环miRNA作为生物标志物还面临一些技术层面的问题。从血清、血浆和其他多种体液中提取miRNA并进行分析早有先例[45]，然而还难以做到对循环miRNA水平的公允评估[46]。首先，尚未发现可靠的内参miRNA可以用来比较不同样本中的循环miRNA的表达水平[47-49]，使用其他内源性小RNAs(例如U6)作为替代或者引入外参(例如cel-miR-39)的效果还存在争议[50]。其次，在用临床血样制备血浆或血清的流程中，包括取血时对抗凝剂的选择(例如肝素或EDTA)、样本处理时离心条件的设定等均会影响到所取得的miRNA组(miRNome)的成分。另外，在执行深度测序之前的一些步骤，比如RNA接头连接、逆转录、扩增等酶学反应，在应用于miRNA研究时常常会表现出依赖于碱基序列的偏差。在当前的技术条件下，从循环血中提取和检测miRNA需尽可能使用一致、简单和快速的方法并且做到批量处理样本以减少系统误差，而今后的方法学应该关注对miRNA样本在不进行复杂扩增的情况下进行有效的检测[51-52]。

3 总结和展望

HCC因其高死亡率和不良预后已经成为世界各国面临的严重的健康问题，早期诊断、持续监测和新疗法的开发是HCC临床管理的重要内容。目前临床对HCC诊断常依靠血清标志物甲胎蛋白和影像学检查，但是一方面，早期HCC患者甲胎蛋白指标的假阴性率约40%[53]，而影像学检查受肿瘤大小等因素的影响常常不易区分肝脏良性病变与HCC。另一方面，从受检者的感受考虑，创伤性的组织活检不适合作为早期诊断和持续监测的检查项目。miRNA的异常表达是HCC中的常见现象，因此可以成为开发检测方法和药物的依据。现有研究支持将血液中一些循环miRNA开发成为HCC的临床诊断标志物，联合检测多种miRNAs或者miRNA与甲胎蛋白联合来诊断HCC在实验中获得了较高的准确度和敏感度。目前仍需要进一步深入研究miRNA与HCC分子机制之间的关系和解决一些临床应用层面的关键问题，例如开发更加便利的针对循环miRNA的提取技术和不依赖核酸扩增的检测技术等，为循环miRNA在临床检验和诊断中的应用提供更加稳固的理论基础和技术支持。

作者贡献声明：高川、宁勇负责课题设计；谢惠君、Rashed Nasot、高川撰写论文初稿；Rashed Nasot、宁勇参与收集数据和修改论文；宁勇指导撰写文章；高川、宁勇最后定稿。