棉花耐盐性鉴定方法探讨

苏 莹 郭安慧 华金平

(中国农业大学 农学院/作物遗传改良北京市重点实验室/杂种优势利用教育部重点实验室，北京 100193)

土壤盐渍化是干旱和半干旱地区限制作物产量关键的环境因素之一。土壤饱和浸提液电导率≥0.40 S/m的土壤定义为盐渍土，相当于40 mmol/L NaCl溶液[1]。棉花中等耐盐(耐盐阈值为0.77 S/m)，是盐碱地的先锋作物。耕地面积减少、我国棉花生产逐渐向盐碱地集中，选用耐盐品种、提高盐碱地棉花产量潜力和稳产性是优先的技术措施之一，因此生产上对于耐盐品种的需求日益紧迫。

棉花耐盐性受基因型影响较大，棉属中不同棉种之间、陆地棉不同品种之间的耐盐性表现出显著差异[2-3]。耐盐鉴定方法一般分为直接鉴定法和间接鉴定法(表1)[4]。其中，直接鉴定法包括胁迫发芽法、形态观察法和产量比较法；间接鉴定法是应用植物生理学、生物化学和细胞学等手段研究盐胁迫应答过程的相关因子的变化，以一个或多个因子为指标来衡量耐盐性。棉花耐盐分子标记的开发和应用，也是间接鉴定法[5-7]。种子萌发期和幼苗期是棉花对盐胁迫最为敏感的时期。种子萌发期主要采用相对成活苗率、相对发芽率、相对盐害或芽长、根长等指标作为鉴定指标[4,8-9]，而幼苗期采用相对株高和相对叶面积等指标作为鉴定标准；或测定生理生化指标[2-3,10-11]，或在生长发育不同时期利用主成分分析、聚类分析或隶属函数法分析多种性状指标，综合反映棉花耐盐性[12-14]。

表1 棉花耐盐性鉴定方法及指标分类Table 1 Classification of the identification methods and indexes of cotton salt tolerance

本研究综合分析1990—2021年国内外棉花耐盐性研究相关报道，拟通过比较、综合已有研究结果，提出相对简便快捷、结果稳定可靠、统一可比的鉴定方法，以期为开展大规模棉花材料耐盐性鉴定提供参考。

1 种子萌发期鉴定

棉花种子萌发期耐盐性鉴定使用的发芽基质主要有滤纸和沙子，通过比较发芽势、发芽率、芽长、芽重、干重和鲜重等性状指标，或计算相对发芽率、相对盐害率、相对成苗率等相对指数来评价棉花的耐盐性。

1.1 滤纸为基质

叶武威等[15]利用双层滤纸法包裹浸涨的棉花种子在培养皿中进行耐盐筛选试验，结果表明，使用质量百分数为0.70%～1.10%(摩尔浓度为120～188 mmol/L)的NaCl溶液进行棉花萌发期耐盐性鉴定更为适宜。谢德意等[16]利用双层滤纸法，滴加0.00%～1.00%、1.20%、1.50%等13个梯度水平的NaCl溶液，统计发芽势和发芽率，发现当NaCl浓度>0.50%(85 mmol/L)时，盐胁迫下发芽势和发芽率与对照差异显著；NaCl浓度>0.70%(120 mmol/L)时，差异极显著。张国伟等[17]设置0(CK)、100、150和200 mmol/L的NaCl浓度梯度进行萌发试验，确定150 mmol/L NaCl为耐盐性鉴定的适宜浓度，以盐害系数隶属函数值和总隶属函数值作为供试棉花品种萌发期的耐盐性鉴定的依据。类似报道还有，白灯莎·买买提艾力等[18]设置6个NaCl浓度梯度(0(CK)、50、100、150、200和300 mmol/L)，比较新疆27个棉花品种的发芽势和发芽率，采用模糊数学隶属函数法进行耐盐性综合评价，确定150 mmol/L NaCl溶液作为棉花耐盐性鉴定浓度。

王俊娟等[19]采用滤纸卷直立包裹浸涨种子发芽，设置0(对照)、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、1.20%和1.40%的NaCl溶液处理，测定棉花发芽势、芽长和芽重等指标，结果发现，影响发芽势的NaCl临界浓度为1.20%，而影响芽长和芽重的NaCl临界浓度为0.80%。吴振良等[20]采用毛巾卷做为基质用0、0.30%、0.45%和0.60%浓度的NaCl溶液浸湿包裹种子进行萌发试验，对14个棉花品种种子进行耐盐性鉴定，确定该方法适宜的上限NaCl溶液浓度为0.60%。

以滤纸为基质鉴定棉花耐盐性已有较多应用。利用150 mmol/L NaCl溶液进行棉花种子滤纸发芽试验[21]，调查发芽势和发芽率，以相对指数作为耐盐指标，准确鉴定419份陆地棉材料的耐盐性。Sun等[22]通过在培养皿中加入0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、和1.20%的NaCl溶液，对‘新陆早17’、‘晋棉8号’、‘豫棉3号’进行耐盐性鉴定，确定1.00%的NaCl溶液浓度为适宜筛选条件。

1.2 沙培基质

叶武威等[4]以沙子为发芽基质，利用NaCl浓度为0～1.00%的沙培进行发芽，以相对成活苗率分为4级作为耐盐性判定指标：高抗(>90.0%)、抗(75.0%～89.9%)、耐(50.0%～74.9%)和不耐(0.0%～49.9%)。结果发现0.40% NaCl浓度时棉花成苗率急剧下降，确定0.40%的土壤含盐量作为棉花生产中盐胁迫筛选的最佳值。通过模拟自然盐碱地条件[23-24]设置5个盐土浓度，利用沙培方法进行萌发和出苗期耐盐性鉴定，NaCl浓度为0(对照)、0.10%、0.20%、0.30%和0.40%(盐重/干沙干重×100%)。根据7 d后的相对出苗率将棉花萌发出苗期耐盐性分为高抗(≥90.0%)、抗(70.0%～89.9%)、耐(50.0%～69.9%)以及不耐(≤50.0%)。结果表明，沙土中0.30% NaCl浓度为影响棉花萌发的临界点。沙土中NaCl≥0.30%，种子萌发受到严重抑制，NaCl<0.30%时，处理和对照出苗率无显著差异。

吴晓东等[25]对102份棉花品种进行耐盐性筛选，以1.00%的NaCl溶液胁迫种子发芽率为标准进行耐盐分级：1级(高抗，H，>90.0%)、2级(抗，R，75.0%～89.9%)、3级(耐，T，50.0%～74.9%)和4级(敏感，S，0.0%～49.9%)，结果发现种子相对发芽率、相对棉苗干物质质量和相对株高是棉花萌发期耐盐性鉴定的可靠指标。利用石英砂作为基质，浇灌0.30%(摩尔浓度51 mmol/L)的NaCl溶液，调查棉花相对存活率和盐害指数，从713份的陆地棉自然群体筛选到160份耐盐品种和18份抗盐品种[26]。刘瑞显等[27]通过沙培方式，利用150 mmol/L NaCl溶液进行处理，以棉花萌发期各个指标的盐害指数的熵值和权重等指标，进行棉花耐盐性鉴定。比较上述研究，以沙培发芽法进行棉花耐盐性鉴定时，沙土中NaCl含量及标准存在差异，有的以“NaCl重/干沙重”的质量百分数为标准进行盐胁迫处理，也有以不同摩尔浓度或质量浓度的NaCl溶液浇灌沙土的方法进行胁迫处理，2种方法中，实际NaCl含量难控制，且试验需要较大空间。

1.3 其他发芽基质

除上述以滤纸和沙子为发芽基质鉴定耐盐性的方法外，陈建平等[28]利用水培方法，设置0.30%～1.50%的NaCl浓度，在布设多个洞穴的泡沫板中填充基质并播种，鉴定棉花萌发期与苗期耐盐性。有研究以0.17%～0.23%的NaCl溶液中脱绒消毒种子的“吐芽率”(种子生长点裂开，下胚轴露出开口称为吐芽)为指标，快速检测棉花耐盐性[29]。该方法快速、简便，但结果的可重复性及其与田间成苗率的相关性需进一步验证。

2 幼苗期耐盐性鉴定

棉花出苗后，植株从异养向自养的过渡，盐胁迫可能引起幼苗畸形，严重时叶绿素合成受阻，形成黄化苗。棉苗在二、三叶期体内已开始分化花芽，此时对盐分最为敏感[30]。因此，棉花幼苗期耐盐性鉴定一般选择两叶或三叶期。已有报道主要以生物量、株高、叶绿素含量、生理生化指标等作为该阶段耐盐性鉴定指标[2-3,10,13]。

2.1 水培鉴定

Guo等[31]采用水培方法，分别以0、50、100、150和200 mmol/L NaCl溶液处理三叶一心期棉花幼苗，发现150 mmol/L NaCl处理后棉花叶片失水萎蔫，随时间延长逐渐恢复，确定150 mmol/L是棉花幼苗期耐盐性鉴定适宜的胁迫处理浓度。通过观察胁迫后棉花幼苗表型变化，分析胁迫后0.5～72.0 h基因表达的差异情况，确定胁迫后3、12和48 h为棉花胁迫表型及恢复的关键时间点[32-33]。利用该方法对陆地棉‘CRI-12’和野生棉‘毛棉’构建的F2∶3群体进行耐盐性鉴定[34]，胁迫2周后获得叶绿素含量、苗高、根长、苗鲜重、根鲜重、苗干重和根干重等表型数据，分析幼苗期耐盐相关QTL。

此外，也有研究通过水培条件[35]，设置100、150、200和250 mmol/L的NaCl浓度梯度，于幼苗三叶期胁迫处理10 d后测定生长指标和生理指标，通过隶属函数和耐盐指数分析，确定200 mmol/L NaCl为水培条件筛选适宜浓度，以叶片相对含水量和光合速率作为苗期耐盐性筛选指标。

2.2 盐池鉴定

叶武威等[4]通过盐池筛选6 000余份棉花种质资源，发现在0.40% NaCl浓度下棉花最敏感，有利于准确鉴定耐盐性差异，确立了0.40%盐量胁迫法(又称盐池鉴定法)作为棉花种质耐盐性鉴定方法，并提出行业鉴定标准。利用0.40%盐量胁迫棉花三叶期幼苗，调查10 d的成活苗率，将棉花耐盐性分为4级：高抗(>90.0%)、抗(75.0%～89.9%)、耐(50.0%～74.9%)和不耐(0.0%～49.9%)。

杨阳[36]在含有250 mmol/L NaCl的盐池中处理两叶一心期棉花幼苗，处理第5(子叶开始发黄)、7和9天开始调查统计叶片受害情况及第一片真叶叶绿素含量；第9天测量株高及根、茎、叶干重，根据叶片受害程度，分3级统计供试材料耐盐性。张香桂等[37]利用穴盘基质，用0、1.00%、1.50%、2.00%、2.50%和3.00%的NaCl溶液处理两叶一心期棉苗，处理后3、5和7 d调查子叶受害情况，计算子叶受害指数，分为5级：0级，棉苗无黄叶；1级，1片子叶发黄；2级，2片子叶均发黄；3级，1片子叶受害脱落；4级，2片子叶受害脱落。并提出：棉苗2叶期，1.50%～2.00% (257～342 mmol/L)NaCl浓度处理7 d，可用于批量筛选棉花品种苗期耐盐性。刘雅辉等[38]采用土壤全盐含量为0.40%的原土盐池，土壤全盐含量0.10%为对照，调查出苗至二叶期幼苗长势及盐害症状，计算盐害指数，确立棉花苗期(二叶期)耐盐性评价标准。

3 全生育期耐盐性鉴定

盐胁迫最终影响棉花产量和纤维品质，因此在盐渍环境比较棉花全生育期的生长情况和产量也可作为鉴定棉花耐盐性的方法[30,39]。

姜益娟等[39]通过分析土壤含盐量对棉花产量和品质的影响，结果发现，土壤总含盐量与产量、单株有效铃、单铃重、株高均呈极显著负相关。土壤含盐量<0.24%，对棉花产量及构成因子起促进作用；含盐量>0.24%，开始产生不良影响；当含盐量>0.50%时，棉花受害逐渐加重。但土壤盐分与纤维品质没有显著的相关性。Guo等[40]通过播种前以含盐量0.50%的自然地下盐水处理耕地，调查土壤盐分对陆地棉重组自交系群体纤维品质的影响，结果发现土壤盐分提高纤维强度，对其他纤维品质性状无显著影响。

孙小芳等[41]采用盐化土壤盆钵全生育期栽培法，设置0、0.15%、0.30%、0.45%和0.60%的NaCl浓度梯度，比较13个陆地棉品种的耐盐性。结果表明，鉴定棉花耐盐性的适宜浓度为0.45%(77 mmol/L)，相对籽棉产量可作为鉴定棉花耐盐能力的可靠简易指标。

另外，王俊铎等[42]利用pH 8.50～8.60、可溶性盐浓度为0.54%的复合盐碱土对119份国内外陆地棉品种资源进行耐盐性鉴定，证明了盐胁迫对衣分、铃重和叶绿素的影响较小，而对果节、铃数和叶面积的影响较大。

4 其他鉴定方法

除利用种子萌发期和幼苗期鉴定棉花品种耐盐性外，李付广等[43]利用棉花组织培养技术，将棉花不同部位组织或细胞培养在加盐培养基中，离体快速鉴定耐盐性。Long等[44-45]在棉花幼苗3～4片真叶时，利用叶盘法进行离体耐盐性鉴定，取相同节位叶片做成1 cm的叶盘，在浓度分别为0和400 mmol/L的NaCl溶液中孵育4 d，通过观察叶片颜色变化鉴定耐盐性。沈法富等[46]利用液滴培养技术(sitting drop culture)，通过统计不同浓度NaCl溶液胁迫培养下花粉萌发率，反映棉花耐盐水平。

利用非损伤微测系统鉴定耐盐性[47-48]，棉花一片真叶时，用含150 mmol/L NaCl营养液处理24 h，利用非损伤微测系统测定根尖的Na+和K+的外排流速，计算Na+/K+外排流速比，Na+/K+外排流速比越大，耐盐性越强[47]。以棉花三叶期在0.30% NaCl的沙培条件胁迫9 d，基于非损伤微测系统测定Na+离子流，并结合GhSOS1基因表达情况，鉴定棉花品种耐盐性[48]。

另外，王为等[49]采用室内试验和室外试验结合进行耐盐种质筛选，室内采用质量百分比浓度0.40% 的NaCl进行双层滤纸法和沙培法发芽，室外试验采用盐池鉴定(NaCl浓度0.00%～0.50%)及海边重盐碱土(可溶性盐含量0.40%～0.80%)，对棉花种质进行多时期、多地点不同水平的耐盐性鉴定。

此外，鉴定棉花种子萌发期耐盐性用到的盐胁迫种类也有差异。盐渍土中盐分类型多样，如氯化物盐、磷酸盐和碳酸盐等。在耐盐性鉴定中，普遍使用中性盐，如NaCl和Na2SO4。但碱性盐，如NaHCO3和Na2CO3，在盐渍化土壤中也大量存在。

李双男等[50]通过设置NaCl、Na2SO4和NaHCO3+Na2CO33种胁迫类型，分析不同盐碱对棉花种子萌发的影响。结果发现，中性盐Na2SO4较NaCl对棉花种子萌发表现出更强的抑制作用，碱性盐在pH 8.60时促进萌发，pH 9.03时抑制萌发，pH 10.47时则完全不萌发。吴巧娟等[51]以盐碱含量5.90%的海水稀释至盐碱含量为0.35%作为处理，以纯净水为对照进行沙培发芽试验，第10天统计出苗率计算相对盐害率作为耐盐指标。吴新海等[52]通过在地下咸水、NaCl溶液和盐碱原土3种情况下进行试验，测定发芽率、出苗率，结果表明，NaCl溶液中棉花发芽率偏高，地下咸水溶液和盐碱原土胁迫发芽率接近。用NaCl单盐溶液进行萌发期耐盐性鉴定，鉴定浓度为0.50%(摩尔浓度86 mmol/L)较适合；用地下咸水和盐碱原土进行鉴定，可溶性盐含量为0.40%较适合；且认为地下咸水最切合生产实际。

5 存在问题及展望

由于不同研究报道中，关于NaCl浓度计算标准不一致(表2)。萌发阶段使用的NaCl质量浓度范围多为0.30%～1.50%，通过比较，认为适宜的筛选浓度为0.40%～1.00%；而采用摩尔浓度的标准，使用的范围为100～300 mmol/L，且多数研究表明，适宜的筛选浓度为150 mmol/L的NaCl溶液。

棉花种子萌发与出苗是田间成苗的关键，盐胁迫下不同基因型的棉花品种发芽率和出苗率存在显著差异[14,18,23,30]，因此在萌发期和幼苗期可直接评价棉花的耐盐性。综合已有研究，在萌发和出苗期，室内条件下，盐胁迫发芽或者出苗试验，盐胁迫条件容易控制，其中以滤纸为发芽基质的方法，操作简单、快速、宜重复，可作为鉴定棉花品种耐盐性的主要方法，但双层滤纸法易发霉，影响鉴定结果。室外条件进行棉花苗期耐盐性鉴定，多以砂培、土培或盐碱原土为发芽基质，用于筛选的NaCl浓度范围为0.30%～1.20%[4,23]，最高达到2.00%[37]，但参试品种、苗龄及发芽基质[52]等方面的不一致，均影响鉴定结果。土壤中可溶性盐含量与盐种类难以统一，且大田鉴定时，土壤含盐量也会受气候影响。因此，室内采用滤纸卷法，以150 mmol/L(质量分数为0.87%，表2)NaCl为适宜胁迫浓度，筛选指标为发芽率、相对发芽率或相对盐害率(表1)，进行耐盐性鉴定，可作为首选方法。室外条件下采用含盐量0.40%的盐池处理棉花三叶期幼苗10 d，统计成活苗率，鉴定棉花苗期耐盐性。

表2 不同NaCl浓度计量对比Table 2 Comparison of different standards of NaCl concentration

利用自然盐碱土进行棉花全生育期的耐盐性鉴定，有利于指导生产实践，但该鉴定方式缺乏系统性评价。利用田间自然盐碱土进行鉴定，存在盐度分布不均匀的情况，且土壤含盐量受年份和气候影响较大。由于自然环境因素的不确定性，如降雨量和积温等，影响自然盐碱土的土壤盐度，降低年份间鉴定结果重复性和精确性，且不同盐碱地环境，鉴定结果/趋势也存在差异，因此室内鉴定与田间鉴定结果可能会出现较大差异，并且该方法测定周期长，成本高。目前新疆是中国棉花的主产区，利用新疆盐碱土建立盐度均匀的盐池或土壤盐分均匀的地块，进行多年多点的全生育期耐盐鉴定对指导生产实践有重要意义。