鲟鳇鱼网箱养殖环境微生物菌群结构及潜在病原菌分析

黄 薇 周华书 刘兰英 罗土炎 宋永康

(1. 福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所, 福建省农产品质量安全重点实验室, 福州 350003;2. 周宁县水产技术站, 周宁 355400)

鲟鳇鱼是地球上现存最古老的脊椎动物, 包括鲟属Acipenser和鳇属Huso, 共2属21种, 其中我国拥有8种，是鲟鳇鱼分布较多的国家[1]。目前, 鲟鳇鱼的所有属种均被列入世界珍稀濒危物种, 如何妥善保护与开发利用这些珍稀濒危物种, 已成为全世界亟不可待的研究课题[1,2]。近年来, 随着养殖环境的不断恶化鲟鳇鱼细菌性疾病发生率不断增加, 给这一珍贵物种造成了不可弥补的巨大损失[3]。

鱼类的健康状况与其生活的水环境密切相关[4]。水环境中生存着大量的已知和未知的细菌菌群, 在水质调控、物质代谢、生态系统稳定及疾病的发生与控制等方面都发挥着重要的作用[5]。崔丙健等[6]认为, 尽管在养殖水环境中病原菌的丰度较低, 但也可能在特定条件下大量增殖, 从而导致水产病害暴发。同时研究显示, 养殖环境中病原菌的数量和种类与鱼类疾病的发生几率及发病类型呈显著正相关[7]。因此, 为了更好的保护和培育鲟鳇鱼这一珍贵物种, 阐明其养殖环境的菌群结构组成是有必要的, 理解养殖环境中的微生物种类和数量将有助于调控养殖环境的微生态平衡、疾病防控及病原菌的快速诊断。

随着高通量测序技术的快速发展, 国内外学者在部分鱼类养殖水环境中的微生物结构组成方面的研究已经取得了初步进展, 包括大黄鱼(Larimichthys crocea)[8]、罗非鱼(Tilapia larvae)[9]、缢蛏(Sinonovacula constricta)[10]和淡水虾[11]等。然而对鲟鳇鱼养殖环境中菌群结构组成研究尚未见到报道。因此, 本文采用高通量测序技术和实时荧光定量PCR等技术手段对福建省周宁县中华鲟保种中心稳定养殖的4个鲟鳇鱼品种的网箱养殖水体细菌群落结构及潜在病原菌存在情况进行了分析, 为该中心鲟鳇鱼养殖过程中的水质调控及疾病预防提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集

试验样品来源于福建省周宁县中华鲟保种中心(北纬27°11′, 东经119°20′), 该中心的鲟鳇鱼为水库网箱养殖, 养殖区平均海拔700 m, 网箱6 m深水温为13—23℃, 昼夜温差不超过2℃, pH为6.8—7.2,网箱养殖密度约200尾/网箱, 养殖所用饵料为人工配合饲料, 每天早晚投喂1次, 日投喂率为鱼体体重的0.5%。样品于2019年9月12日采集, 随机选取中心稳定养殖的4个鲟鳇鱼品种(中华鲟A. sinensis、施氏鲟A. schrenckii、达氏鳇H. dauricus和大杂交鲟A. schrenckii♂×H. dauricus♀)养殖网箱各3个, 在每个网箱的四角各设1个采样站位, 利用500 mL的含0.4 mg硫代硫酸钠的无菌水样采集袋采集水深5 m处(网箱水深6 m)的水样, 将各网箱采集的水样混合均匀后装于灭菌容器, 4℃运输和保存, 样品相关指标的测定和DNA提取在24h内完成。样品命名: 中华鲟网箱养殖水体样品编号为Z1、Z2和Z3,施氏鲟网箱养殖水体样品编号为S1、S2和S3, 达氏鳇网箱养殖水体样品编号为H1、H2和H3, 大杂交鲟网箱养殖水体样品编号为D1、D2和D3。

1.2 水质测定

水温、pH和溶解氧(DO)均在现场进行测定,采用便携式多参数测试仪SG68-ELK-ISM(MettlerToledo, Zurich, Switzerland)进行测定, 仪器使用前均已校正。实验室测定指标包括氨氮N)、总磷(TP)、高锰酸盐指数(CODMn)和五日生化需氧量(BOD5), 分析方法如下:N采用纳氏试剂分光光度法(HJ 535-2009)、TP采用钼酸铵分光光度法(GB 11893-1989)、CODMn采用酸式滴定法(GB11892-1989)和BOD5采用稀释与接种法(HJ05-2009)。

1.3 基因组DNA提取

取各网箱养殖水体1 L, 首先利用5.0 μm滤膜滤去浮游动植物和大颗粒物; 再利用0.22 μm滤膜截留微生物。获得的滤膜样品利用强力水样微生物总DNA提取试剂盒(MOBIO, Carlsbad, CA, USA)提取DNA, 用Qubit 2.0 荧光定量仪(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)进行定量, 提取的DNA样品放置在-80℃冰箱中保存备用。

1.4 PCR扩增和Illumina测序

PCR扩增采用16S rRNA基因V3—V4区的通用引物341F和805R。PCR反应体系总体积 30 μL, 含模板DNA 20 ng。PCR扩增程序为: 94℃, 3min;(94℃, 30s; 45℃, 20s; 65℃, 30s)×5; (94℃, 20s;55℃, 20s; 72℃,30 s)×20; 72℃, 5min。得到的PCR产物经QIAquick PCR 纯化试剂盒(Qiagen,Düsseldorf, Germany)纯化后, 送生工生物工程(上海)股份有限公司Illumina MiSeq平台进行高通量测序, 测序得到的原始数据提交到NCBI的 SRA数据库, 序列登录号为SRP251784。

1.5 高通量数据处理

Illumina MiSeq测序得到的原始数据, 首先使用FLASH软件[12]根据序列间的overlap关系将成对的序列拼接成一条序列; 再运用Cutadapt软件[13]去除测序时加入的引物和接头序列, 按照barcode标签序列识别并区分样品; 然后使用Prinseq软件[14]对各样品数据质量进行质控过滤; 所得各样本的有效数据再经过Usearch软件[15]去除嵌合体以及进行Operational Taxonomic Units (OTUs)聚类分析; 对OTU代表序列利用Ribosomal Database Project (RDP)classifier比对RDP数据库进行物种注释[16]; 利用Mothur软件对单样品的微生物多样性(alpha多样性)进行分析[17]; 采用QIIME软件计算两两样本间的weighted UniFrac距离, 用于beta多样性分析[18]。

1.6 荧光定量PCR标准曲线构建及定量PCR

参考文献中报道的鲟鳇鱼典型致病菌16S rRNA序列设计的特异性引物序列, 经过多重比对验证试验后, 筛选出3对PCR引物(表 1)。以所提样品DNA为模板进行常规PCR扩增, 扩增后的PCR产物经过纯化后, 与pMD18-T载体接连转化至大肠杆菌DH5α中, 挑取转化后的阳性克隆子利用QIAGEN Plasmid Mini Kit(Qiagen, Düsseldorf,Germany)提取质粒DNA, 送测序公司验证插入的基因片段是否正确, 验证正确后测定质粒浓度并绘制标准曲线。

表1 用于实时荧光定量 PCR 检测的引物Tab. 1 RT-PCR primers sequences used in assay

将已知拷贝数的质粒作为标准模板, 采用LightCycler480 II型荧光定量PCR仪(Roche,Rotkreuz, Switzerland)进行实时荧光定量PCR扩增。荧光定量PCR反应体系总体积 10 μL, 含2×SG Fast qPCR Master Mix 5 μL, 模板DNA 10 ng。荧光定量PCR扩增程序为: 95℃, 3min; (95℃, 5s;55/60℃, 30s; 72℃, 45s)× 45; 72℃, 10min。熔解曲线条件: 95℃, 1min; 55℃, 30s; 95℃, 30s。所有反应均设置3个重复, 每轮反应均以无菌 ddH2O 代替模板DNA作为阴性对照。

1.7 数据统计分析

在本研究中, 平均值和标准偏差采用Excel软件计算;P-values采用SPSS软件计算, 单因素方差分析运用Least Significant Difference (LSD法); PCoA图、柱状图、热图和韦恩图采用R软件绘制。

2 结果

2.1 鲟鳇鱼养殖水体水质分析

从表 2可以看出, 中华鲟保种中心水库水质良好, 水温适合鲟鱼生长, pH呈中性, 网箱养殖水体中的DO、和CODMn达到Ⅱ类水质标准,BOD5和TP达到Ⅲ类水质标准。中华鲟及其他鲟鳇鱼网箱养殖水体的水质指标含量基本一致, 除BOD5外, 不同品种鲟鳇鱼网箱养殖水体的水质指标含量不存在显著差异(P≥0.05)。

表2 四种鲟鳇鱼网箱养殖水体水质分析Tab. 2 The characteristics of water quality in four sturgeon species cage culture environments (mean±SEM, n=3)

2.2 鲟鳇鱼养殖水体细菌群落结构特征分析

从表 3可知, 中华鲟、施氏鲟、达氏鳇和大杂交鲟养殖水环境样品中分别获得有效16S rRNA序列数为51537±3709、66785±13726、56344±19476和58587±7538 条, 平均每个样品获得OTUs为1163个。根据各样品的Good’s coverage指数＞99%,可知本研究的测序结果可以代表样本的真实情况。Alpha多样性分析结果表明, 大杂交鲟养殖水体的OTUs及ACE要显著高于其他品种, 表明大杂交鲟养殖水体中的物种总数较高。一般来说,BOD5值越高, 水质有机物浓度越高, 细菌的物种数也会越丰富。除此之外, 其余Alpha多样性指数(Chaol、Shannon和Simpson)无显著性差异(P≥0.05), 表明各样品间的微生物结构组成基本一致。根据weighted Unifrac距离进行PCoA分析, 从分析结果可知(图 1), PCoA图的前3个主坐标可以代表83.1%的变量信息, 除其中一个中华鲟网箱养殖水体样品外, 其余样品均聚在一起, 表明这些鲟鳇鱼养殖水体中的微生物结构和组成十分相似。

表3 Illumina测序数据统计分析Tab. 3 Statistical indexes calculated based on the Illumina sequencing data (mean±SEM, n=3)

图1 基于weighted UniFrac距离的样品细菌群落结构PCoA分析Fig. 1 Principal coordinates analysis (PCoA) of community compositions in samples microbiota based on weighted UniFrac

12个鲟鳇鱼养殖水体样品共获得20个门类细菌(图 2)。不同品种鲟鳇鱼网箱养殖水环境中的优势菌门基本一致, 均由Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Verrucomicrobia和Planctomycetes组成, 这些优势门类分别占到所有样品序列总数的88.81%—93.94%。其中, 丰度最高的菌门为Proteobacteria, 占样品序列总数的35.98%—39.94%,其次是Actinobacteria, 占样本序列总数的21.77%—24.70%。差异显著性分析结果显示, 这些优势细菌门在各鲟鳇品种网箱养殖水体中的丰度不存在显著性差异(P≥0.05), 说明各鲟鳇鱼网箱养殖水体中的微生物结构组成在门水平上基本一致。

图2 门水平下各鲟鳇鱼品种网箱养殖水体中细菌群落结构组成Fig. 2 The taxonomic composition distribution in samples at the phylum level

在各鲟鳇鱼品种网箱养殖水体样品中, 共检测到224个细菌属, 对丰度前50的细菌属进行热图分析(图 3), 养殖水体中细菌种群有高达34.77%—58.81%的物种未分类, 除此之外相对丰度在2%以上的细菌属主要有Ilumatobacter(3.59±0.97)%、Sediminibacterium(2.38±0.56)%、Acinetobacter(2.53±3.33)%、Spartobacteria_genera_incertae_sedis(2.13±0.68)%和Subdivision3_genera_incertae_sedis(2.01±1.91)%。同时统计结果显示, 这些优势菌属在各鲟鳇品种网箱养殖水体的差异不显著(P≥0.05), 表明在属水平上, 各鲟鳇鱼网箱养殖水体中的优势菌属结构组成相似。

图3 属水平下各鲟鳇鱼品种网箱养殖水体中细菌群落结构组成Fig. 3 The taxonomic composition distribution in samples at the genus level

2.3 鲟鳇鱼网箱养殖水体细菌群落组成比较分析

通过构建韦恩图来分析不同品种鲟鳇鱼网箱养殖水体样品中所共有的和特有的OTU数目(图 4)。中华鲟、施氏鲟、达氏鳇和大杂交鲟网箱养殖水体共有了1059个OTUs, 统计分析表明, 共有的OTUs序列分别占中华鲟、施氏鲟、达氏鳇和大杂交鲟网箱养殖水体序列总数的99.13%、98.44%、99.21%和99.18%。因此, 不同鲟鳇鱼网箱养殖水体中的核心菌群是一致的。此外, 中华鲟、施氏鲟、达氏鳇和大杂交鲟网箱养殖水体中还含有特有的OTUs分别为70、156、43和68个, 分别占中华鲟、施氏鲟、达氏鳇和大杂交鲟网箱养殖水体总序列数的0.13%、0.51%、0.08%和0.09%。

图4 不同品种鲟鳇鱼网箱养殖水体中共有的和特有的OTUsFig. 4 Venn diagram displaying the number of shared and unique OTUs in the different sturgeon cage culture water

2.4 中华鲟及其他鲟鳇鱼养殖水体中潜在病原菌分析

在本研究检测的网箱养殖水体样品中共发现鲟鳇鱼病原菌菌属7个, 主要包括Aeromonas、Acinetobacter、Chryseobacterium、Edwardsiella、Flavobacterium、Pseudomonas和Vibrio。从表 4可以看出, 7个潜在病原菌菌属在不同鲟鳇鱼养殖水体中的分布规律较为接近, 但是7个潜在致病菌菌属的相对丰度存在显著性差异(P＜0.05), 除中华鲟养殖水体中Pseudomonas＞Flavobacterium外, 其余相对丰度大小均表现为:Acinetobacter＞Flavobacterium＞Pseudomonas＞Aeromoas＞Chryseobacterium＞Vibrio＞Edwardsiella。

表4 不同品种鲟鳇鱼网箱养殖水体中潜在病原菌属及分布Tab. 4 Potential pathogens distribution in the different sturgeon cage culture water (mean±SEM, n=3)

利用荧光定量PCR对已报道鲟鳇鱼养殖过程中的典型病原菌进行检测。从图 5可以看出,A. hydrophila在养殖水体中的丰度[(7406±1892) copies/mL]要高于或显著高于(P＜0.05)其他病原菌, 其次为F. columnar[(4889±1649) copies/mL)和P. fluorescens[(3259±1117) copies/mL)。

图5 网箱养殖水体中病原微生物丰度Fig. 5 Frequency of pathogenic microorganisms in cage culture water

3 讨论

养殖水体中存在着大量的已知和未知微生物,其与水生生物体内寄生的微生物菌群相互作用、相互影响, 形成了复杂的细菌-细菌、细菌-宿主互作关系, 从而对水生生物的健康成长产生重要的影响[20]。大量的研究表明, 明确养殖环境中的微生物结构组成将有助于病害控制防治、益生菌筛选及病原菌发病机制研究等工作[8,21]。因此, 本研究采用高通量测序技术, 对4种鲟鳇鱼网箱养殖水体中的微生物的结构组成及潜在病原菌分布进行了分析和比较。

从16S rRNA基因高通量测序结果来看, 不同品种鲟鳇鱼在同一水域同一管理条件下, 其养殖水体中核心菌群基本一致, 优势菌群主要由Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Verrucomicrobia和Planctomycetes组成, 这与已报道的罗非鱼[22]、草鱼[23]、鱼菜共生[24]和鱼贝混养[25]等养殖水环境的优势菌群相似。研究显示, Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes和Planctomycetes在脱氮除磷、降解大分子、有机物质转换及产生抗菌类物质等密切相关, 这些优势微生物的存在对于鱼类健康养殖有重要意义[24,26,27]。而Verrucomicrobia是污染程度的指示菌群[28], 在未受污染的沉积物中普遍存在, 在污染的沉积物中出现缺失, 这与本研究检测出鲟鳇鱼网箱养殖水质指标较好(处于Ⅱ—Ⅲ级)相吻合。同时, 新近的研究显示, 鱼类肠道中的优势微生物也来自于Proteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes[29,30], 这在一定程度上也说明了水生生物与其水环境中的微生物之间存在紧密的互作关系。

在属水平上, 各样品未分类的细菌(unclassified)占比都超过34%, 占比最高达到58.81%, 说明鲟鳇鱼养殖水体中的微生物种类复杂多样, 有大量的微生物未被人们熟知, 同时也表明利用传统的培养分离等方法很难得到全面、准确的结果[31]。因此, 为了更好地培育这一珍贵物种, 采用高通量测序技术阐明其养殖环境中的微生物结构组成十分必要。在水产养殖实践中, 养殖环境中的许多致病菌, 尤其是条件致病菌大量增殖导致的水产病害频发是水产养殖过程面临的主要问题[6]。该结果证实了鲟鳇鱼典型病原菌在养殖环境中的普遍性, 本文采用高通量测序技术在网箱养殖水体样本中共发现鲟鳇鱼病原菌菌属7个。

基于16S rRNA片段基因高通量测序技术能够解析样本中微生物的总体结构, 取得更多不能通过分离培养技术获取的细菌种类信息, 但限于二代高通量测序技术测序长度偏短, 其对于具体到种一级的信息辨别能力不足[20], 这对于获取种间关系复杂的病原菌信息难度较大。为此, 本试验利用实时荧光定量PCR的方法对网箱养殖环境水体样品中常见的典型鲟鳇鱼致病菌进行定量检测, 检测结果显示A. hydrophila在养殖水体中的丰度要高于F. columnar和P. fluorescens, 这与高通量测序检测的致病菌属结果不一致。尽管16S rRNA基因片段的PCR引物扩增的特异性会出现一定的差异, 但推测主要原因还是在于致病菌属包含了不止一种的致病菌种。Aeromoas广泛存在于自然界及健康鱼体的肠道中,属于条件致病菌。根据田甜等[3]和杨移斌等[32]的报道,A. hydrophila是中华鲟及其他鲟鳇鱼病害最常见的病原菌, 可导致红嘴病、腹水病和败血症等的发生。在鲟鳇鱼的养殖过程中, 病原菌的早期监控对疾病防控具有极为重要的作用, 本研究的结论将有助于针对性地指导对该区域中华鲟等鲟鳇鱼养殖过程进行科学防病和水质调控。

4 结论

在同一水域同一管理条件下, 不同品种鲟鳇鱼网箱养殖水体中的细菌组成与丰度基本一致, 优势菌门均由Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Verrucomicrobia和Planctomycetes组成,优势菌属为Ilumatobacter、Sediminibacterium、Acinetobacter、Spartobacteria_genera_incertae_sedis和Subdivision3_genera_incertae_sedis, 表明不同鲟鳇鱼的养殖生态环境管理经验是可以相互借鉴的。在鲟鳇鱼网箱养殖环境中, 共发现鲟鳇鱼病原菌菌属7个:Aeromonas、Acinetobacter、Chryseobacterium、Edwardsiella、Flavobacterium、Pseudomonas和Vibrio, 实时荧光定量PCR检测结果显示, 在鲟鳇鱼养殖过程中最常见的病原菌A. hydrophila的丰度最高, 为(7406±1892) copies/mL, 其次F. columnar的丰度为(4889±1649) copies/mL及P.fluorescens的丰度为(3259±1117) copies/mL。