祛风通络配伍对高糖诱导人肾小管上皮细胞活力及炎症反应的影响

苏冠旬 李丽娜 赵进喜 陈宇 薛泰骑 魏金艳 王淑艳 王世东

糖尿病肾病(diabetic nephropathies，DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，亦是导致糖尿病患者死亡的主要原因[1]。本团队长期从事中医药防治DN的研究，学术奠基人吕仁和教授提出DN“微型癥瘕”病机理论，强调益气化瘀散结，防止“微型癥瘕”的形成是治疗DN的关键[2-3]，并在研究中证实了益气化瘀散结法可以明显改善DN肾功能不全患者的临床症状、肾功能及血脂紊乱[4]，降低终点事件的发生率[5]。本团队在继承吕仁和教授学术思想的基础上，经过多年临床实践及实验研究，提出DN“肾络伏风”病机理论和“从风论治”治疗思路，认为在肾络“微型癥瘕”形成过程中，风邪也发挥了重要作用[6-7]，DN的治疗在益气的基础上，除了化瘀散结，还应注重祛风通络法的应用，临床上使用益气祛风通络方(黄芪、鬼箭羽、牛蒡子、穿山龙、蚕砂)治疗DN取得了一定的疗效。既往研究发现，益气祛风通络方中祛风通络配伍(牛蒡子、蚕砂、穿山龙)在治疗DN方面具有一定的降低蛋白尿、延缓肾纤维化的作用，其机制与抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶/核转录因子-κB(phosphatidylinositol-3-kinase/serine-threonine protein kinase/transcriptional nuclear factor-κB-1,PI3K/AKT /NF-κB)信号通路，下调转化生长因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1, MCP-1)等炎症因子的表达水平有关[8-9]。为进一步从分子生物学角度揭示祛风通络配伍治疗DN的机制，以及“从风论治”法的合理性，本实验对祛风通络配伍改善高糖诱导人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cell,HKC)炎症反应的分子机制进行了研究。

1 材料与方法

1.1 动物及细胞株

SPF级Wistar雄性大鼠20只，体质量290～300 g，许可证号：SCXK(京)2016-0002，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物饲养于北京中医药大学动物实验室，实验经北京中医药大学动物实验伦理委员会审核并批准，审批号：BUCM-4-2021060901-2049。HKC购自北京协和细胞资源中心。

1.2 实验药物

祛风通络配伍颗粒剂,组成：牛蒡子15 g、穿山龙30 g、蚕砂9 g，购置于北京康仁堂药业有限公司。

1.3 主要试剂及仪器

低糖DMEM培养液(Hyclone公司，批号：SH30022.01B)；高糖DMEM培养液(Hyclone公司，批号：AD20616263)；胎牛血清(美国Gibco公司，批号:2045677RP)；SB203580(上海陶素公司，批号:152121-47-6)；CCK-8试剂盒(上海同仁化学研究所，批号:NV547)；白细胞介素1β(interleukin 1β, IL-1β)、白细胞介素6(interleukin 6, IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)ELisa试剂盒(美国Invitrogen公司，批号:88-7261、88-7066、88-7346)；细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1) antibody(Proteintech公司，批号:10020-1-AP)，p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase, p38 MAPK) antibody(美国CST公司，批号:3690)，MCP-1 antibody、β-actin antibody、HRP标记羊抗鼠、羊抗兔IgG(Abcam公司，批号:ab9669、ab6276、ab6789、ab6721)；Total RNA Extraction Kit、mRNA cDNA Synthesis Kit、mRNA/lncRNA qPCR Kit(北京GenePool公司，批号:GPQ1801、GPQ1803、GPQ1808)。

双垂直电泳槽(CAVOY，型号：MP-8001)；转移槽(CAVOY，型号：MP-3030)；温控摇床(其林贝尔，型号：TS-2000A)；电泳仪(CAVOY，型号：PP-1150)；荧光定量PCR仪(Bioer Technology，型号：Line Gene 9600 Plus)；分光光度仪(Thermo scientific，型号：NANODROP 2000)。

1.4 药物血清制备

将20只大鼠采用随机数字表法分为空白组和祛风通络组，每组10只。祛风通络组每日给予祛风通络配伍47.2 g/kg灌胃，正常组灌服同体积生理盐水，上、下午各1次，连续灌胃3天。末次灌胃后2小时，麻醉后在大鼠股动脉无菌采血。将采集到的血液4℃下静置4小时，3 000 r/min离心20分钟，分离血清，56℃水浴中灭活30分钟，过滤除菌，-20℃保存。

1.5 细胞培养及分组

从液氮中取出HKC，迅速复苏，接种于含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中，存放于37℃、5%CO2培养箱中，以后每1～2天完全更换培养液1次，待细胞长满后用0.25%胰酶消化，进行细胞传代，均匀传入细胞瓶。

当细胞铺满瓶底80%～90%时，换无血清培养基同步化24小时，之后对细胞进行分组处理。正常组：89%DMEM低糖培养基+10%大鼠正常血清+1%双抗；模型组：89%DMEM高糖培养基+10%大鼠正常血清+1%双抗；抑制剂组：89%DMEM高糖培养基+10%大鼠正常血清+1%双抗+5 μmol/L SB203580预处理；祛风通络组：89%DMEM高糖培养基+10%祛风通络配伍药物血清+1%双抗。继续培养不同时间用于后续实验。

1.6 检测指标

1.6.1 细胞活力值 将重悬的HKC以5×104个/mL接种于96孔板并进行分组，每组6个复孔。细胞贴壁并生长状态良好后进行干预给药，分别于24小时、48小时后进行CCK-8检测。按照说明书，每孔均加入100 μL的含10 μL CCK-8的培养基，37℃孵育2小时，在酶标仪450 nm波长下进行OD值检测，并比较各组光密度(optical density,OD)值。

1.6.2 IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平 培养48小时后收集各组细胞上清液后离心，取上清液采用Elisa试剂盒检测 IL-1β、 IL-6、TNF-α的含量，比较各组细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平，每个指标均设3个重复。具体操作依照Elisa试剂盒说明书进行。

1.6.3 IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1、MCP-1、p38 MAPK的mRNA表达水平 培养48小时后收集各组细胞，提取组织样本RNA进行电泳，以检测RNA的完整性。用mRNA cDNA Synthesis Kit试剂盒进行反转录，冰上操作并依次按照说明加入各组试剂，42℃孵育50分钟，85℃孵育5分钟，反应结束后短暂离心，得到的cDNA放置-20℃保存。引物由北京基谱生物科技有限公司提供，引物序列及长度见表1。将反应体系进行95℃ 30秒，95℃ 5秒，60℃ 30秒×45个循环，分别测定待测样本目的基因及内参的Ct值，计算并比较各组细胞IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1、MCP-1、 p38 MAPK的mRNA表达水平，每个指标均设3个重复。

表1 引物序列及产物大小

1.6.4 ICAM-1、MCP-1、p38 MAPK的蛋白表达水平 培养48小时后收集各组细胞，加入蛋白裂解液，提取细胞总蛋白。按常规方法进行SDS-PAGE电泳，转膜，封闭，一抗、二抗孵育，然后进行显色、拍照。重复3次。结果采用Quantity One v.4.6.2软件分析相对灰度值，统计并比较各组细胞ICAM-1、MCP-1、p38 MAPK蛋白的表达水平，每个指标均设3个重复。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 不同时间点各组HKC的细胞活力比较

与正常组相比，模型组OD值显著降低，提示细胞活力显著降低(P<0.05)；与模型组相比，高糖培养48小时后，抑制剂组细胞活力显著提高(P<0.05)，高糖培养24小时、48小时后祛风通络组细胞活力显著提高(P<0.05)。结果见表2。

表2 不同时间点各组HKC的OD值比较

2.2 祛风通络配伍对IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平的影响

与正常组相比，模型组IL-1β、IL-6、TNF-α的含量明显增加(P<0.05)；与模型组相比，抑制剂组与祛风通络组IL-1β、IL-6、TNF-α的含量明显减少(P<0.05)。结果见表3。

表3 祛风通络配伍对各组HKC的IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平的影响

2.3 祛风通络配伍对IL-1β、IL-6、TNF-α、p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1的mRNA表达的影响

与正常组相比，模型组IL-1β、IL-6、TNF-α、ICAM-1、MCP-1、p38 MAPK的mRNA表达明显增加(P<0.05)；与模型组相比，抑制剂组与祛风通络组各指标mRNA表达均明显降低(P<0.05)。结果见表4～5。

表4 祛风通络配伍对各组HKC的IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达的影响

表5 祛风通络配伍对各组HKC的p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1 mRNA表达的影响

2.4 祛风通络配伍对p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1蛋白的表达显著升高(P<0.05)；与模型组比较，抑制剂组与祛风通络组p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1蛋白的表达显著降低(P<0.05)。结果见图1、表6。

注：A 正常组；B 模型组；C 抑制剂组；D 祛风通络组。

表6 祛风通络配伍对各组HKC的p38 MAPK、ICAM-1、MCP-1蛋白表达的影响

3 讨论

中医学认为糖尿病肾病当属于《黄帝内经》中“消瘅”的范畴[10]，《灵枢·五变》：“余闻百疾之始期也，必生于风雨寒暑，循毫毛而入腠理，或复还，或留止，或为风肿汗出，或为消瘅”，明确指出“消瘅”发病与风邪相关。风为百病之长，其善行而数变的特性与糖尿病并发症多、病情进展快的特点相类似。一方面，外感风寒、风热或风湿等邪气可加重糖尿病肾病的病情；另一方面，风邪入里可伏于肾络，与痰、湿、瘀、郁相胶结，使得病情愈加复杂、缠绵难愈。观察发现，糖尿病肾病常见皮肤瘙痒、疼痛走窜、头晕目眩、腿脚抽筋等“风毒”和“内风”的表现[11]。故糖尿病肾病的治疗尚需重视祛风通络法的运用。

一些研究表明，“风药”具有一定的抗炎、调节免疫的作用[12-14]。本研究中使用的祛风通络配伍包含牛蒡子、穿山龙、蚕砂，牛蒡子疏风清热以散外风，穿山龙祛风除湿、通络止痛，蚕砂为祛风除湿之要药，三者相须为用，共奏祛风通络之功。现代药理学研究表明，牛蒡子主要成分为牛蒡子苷和牛蒡子苷元等具有降压、降血脂、抗炎等作用[15-16]。研究表明，牛蒡子提取物可以减轻大鼠肾组织TGF-β1、MCP-1 mRNA的表达[17]，同时可以减少血清肌酐、血尿素氮及24小时尿蛋白，对肾脏具有一定的保护作用[18-19]。穿山龙可以降低血清TNF-α、抑制TNF-α mRNA的表达，并且可通过抑制IL-1β的分泌影响其下游的PI3K、CXCR4、JAK-STAT、NF-κB信号通路进而减轻炎症反应[20-22]。蚕砂也有显著的抗炎镇痛作用，研究发现蚕砂提取物能调节细胞因子代谢、改善免疫功能，特别是促进CD4+回升和CD4+/CD8+的比值恢复[23]。因此，本实验中的祛风通络配伍对糖尿病肾病的治疗有着充分的中医学理论依据和药理学研究基础。

既往研究认为，在DN的发生进展过程中，最重要的病理生理变化是肾小球发生不可逆的纤维化，而肾小管损伤只是继发现象。近期研究表明，肾小管损伤与DN的严重程度密切相关，且肾小管病变可不依赖于肾小球的改变[24]。在糖尿病的发生进展中，若肾小管持续处于高糖环境中就会诱导肾小管上皮细胞凋亡，进而出现肾小管萎缩、变性、进一步发展成肾小管间质纤维化，导致不可逆的终末期肾功能衰竭[25]。本研究结果表明，高糖能明显诱导肾小管上皮细胞损伤，表现为细胞存活率的降低，在SB203580预处理及祛风通络配伍含药血清干预后，肾小管上皮细胞的存活率明显提高，说明高糖环境成功诱导了肾小管上皮细胞的凋亡，并且祛风通络配伍可以提高细胞活力，对肾小管上皮细胞具有一定的保护作用。

p38 MAPK是MAPKs家族中4个主要信号转导途径之一，与肾脏炎性损伤过程中的细胞内信号转导关系密切[26-27]。p38 MAPK作为该通路的关键分子进入细胞核，调控部分转录因子的表达，促进MCP-1、TGF-β1和TNF-α、IL-6等相关炎症细胞因子的产生，而其产生的MCP-1与其相应受体结合后可上调某些黏附分子如ICAM-1、VCAM-1的表达，促进炎性细胞如单核、巨噬细胞向炎症反应部位聚集，从而增加组织细胞的炎性浸润。本研究发现，高糖能明显诱导肾小管上皮细胞炎性反应，表现在细胞上清液中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α升高，细胞中ICAM-1和MCP-1蛋白的表达显著增高。祛风通络配伍含药血清干预后，能明显减少IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌以及ICAM-1、MCP-1蛋白的表达，并抑制p38 MAPK的表达，说明祛风通络配伍能减轻炎症反应，从而延缓糖尿病肾病的进展。本研究结果只能说明祛风通络配伍发挥抑制高糖诱导肾小管上皮细胞炎性反应的作用可能与p38 MAPK信号通路有关，而该通路是否为直接作用靶点以及是否存在其他与之关联的机制，尚需在后续研究中进一步探索。

综上，祛风通络配伍可能通过p38 MAPK信号通路抑制高糖诱导HKC的凋亡，提高细胞活力，减轻炎症反应。该研究结果可为“从风论治”糖尿病肾病的机制提供一定的依据。