肝细胞癌早期诊断中的生物标志物

刘熙称，王艺颖，童曼曼，秦俊杰

吉林大学第一医院 a.肝胆胰内科, b.急诊内科，长春 130021

原发性肝癌是全球第六大常见恶性肿瘤和第四大癌症相关死亡原因[1]。肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝癌，主要在病毒性肝炎、酒精和代谢相关脂肪性肝病等引起的慢性炎症和纤维化的背景下发生[2]，其 5年生存率常低于20%[3]。由于目前的生物标志物早期诊断HCC困难，因此大多数患者一旦被诊断即为晚期，并(或)伴有肝内或远处转移。患者已不适合接受治愈性治疗(切除或移植)，姑息性治疗成为唯一选择[4]。由此可见，HCC的早期诊断显得尤为重要。目前，血清AFP检测是一种常用且重要的早期诊断HCC的方法，但其低敏感度和特异度限制了诊断效能[5]。因此，迫切需要开发新的早期诊断方法提高HCC检出率，并能实时监测肿瘤转归，从而提高患者的治愈率和生存率。

1 传统的生物标志物

1.1 甲胎蛋白(AFP) AFP于20世纪60年代首次被引入作为HCC的血清学标志物[6]，因其检测简单易行且便于筛查，是当前我国诊断HCC和监测疗效的常用指标[7]。一项针对5581例HBV感染者的随机对照试验表明[8]，AFP的半年筛查方案可提高HCC检出率，但肿瘤更早的检出并不能降低病死率。此外，直径小于2 cm的病变，AFP很少升高。AFP的固有缺点是在妊娠、慢性或活动性肝病、生殖腺胚胎源性肿瘤以及其他消化道肿瘤中也可升高。即使使用低水平的临界值(即10～20 ng/ml)，AFP诊断HCC的敏感度约为60%，特异度约为90%[9]。因此，美国肝病学会实践指导委员会不再推荐AFP用于HCC的早期检测[10]。目前，已开发出许多候选标志物用于HCC筛查及诊断[11]，如AFP异质体(AFP-L3)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC3)、脱-γ-羧基-凝血酶原(des-γ-carboxy-prothrombin，DCP)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、Dickkopf-1 (DKK1)、血清鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCCA)及SCCA-IgM和高尔基体糖蛋白73(Golgi protein-73，GP73)。我国学者推荐，对于血清AFP阴性人群可借助AFP-L3、DCP和血浆游离微小RNA(microRNA,miRNA)进行早期检测，提高其诊断效能[7]。

1.2 AFP联合其他血清生物标志物的诊断价值 HCC是由多种危险因素引起的具有多种致病机制的复杂疾病，因此很难用单一生物标志物进行诊断。虽然AFP作为一种生物标志物在HCC筛查中有其局限性，但与其他血清标志物联合应用，可提高HCC诊断的敏感度和特异度。Choi等[12]进行了一项由689例肝硬化和/或慢性乙型肝炎(CHB)患者组成的前瞻性研究，通过分析AFP、AFP-L3和DCP的受试者工作特征曲线下面积(AUC)，发现AFP联合AFP-L3可显著提高HCC早期诊断的效能(AUC=0.83)。Ding等[13]研究发现，AFP结合ALT、AST和中性粒细胞-淋巴细胞比对HBV相关HCC的诊断性能优于单一生物标志物或其他组合，其诊断方程可作为区分HBV-HCC与CHB的有用工具。

2 新型的生物标志物

2.1 乙型肝炎核心相关抗原(hepatitis B core-related antigen，HBcrAg) CHB可能会发展为肝硬化和HCC，因此，在具有高病毒复制活性或晚期纤维化的高危患者中预测HCC的发展非常重要。HBcrAg与血清HBV DNA和肝内共价闭合环状DNA(cccDNA)相关[14]。一项大型队列研究[15]表明，血清HBcrAg水平预测未经治疗的CHB患者发生HCC的能力明显优于HBV DNA。一项针对2666例慢性HBV感染者(基因型B或C)的长期随访研究[16]发现，HBcrAg水平是HCC的独立危险因素。值得关注的是，HBcrAg水平为10 KU/ml时，可以识别出具有高HCC风险的中等病毒载量患者。Suzuki等[17]进一步研究发现HBsAg和HBcrAg值的组合是评估HCC风险的极佳生物标志物。

2.2 液体活检 液体活检标本包含循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTC)或凋亡细胞或活细胞释放形式的遗传信息。无细胞核酸可以在体液中自由循环或被胞外小泡(如外泌体)吸收。癌细胞释放到循环中的无细胞核酸被称为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)[18-19]。Xu等[20]在HCC组织中鉴定出与健康个体的血液白细胞相比呈差异富集的ctDNA甲基化标志物组，研究发现了10个基于甲基化模式的标记组在HCC诊断中的敏感度和特异度分别为85.7%和94.3%。因此，从外周血样本中鉴定出的HCC甲基化的变化特征，也有可能作为诊断HCC的生物标记[19]。另有研究[21]报道，HCC患者外周血中所有类型的CTC数量均明显大于非恶性肝病患者(P<0.05)。总CTC在诊断HCC方面比AFP更有效(AUC=0.821，95%CI：0.756～0.886)，联合使用总CTC和AFP可以增强诊断HCC的敏感度。Li等[22]通过建立健康个体和癌症患者的大规模血液细胞外囊泡长链RNA(extracellular vesicle long RNA，exLR)图谱，发现了基于exLR的液体活检在癌症诊断中的作用。其中，8个exLRs可以作为诊断HCC的生物标志物，具有很高的诊断效能(AUC=0.952 7,95%CI：0.917 0～0.988 3)。exLR标记的优势在于不仅可以区分开癌症患者与健康个体，而且还可以确定肿瘤的起源。此外，还能通过靶向测序轻松地检测出特异性RNA标记，这意味着未来可作为常规且经济高效的诊断方法。

2.3 外泌体 研究[23]表明，血清外泌体中信使 RNA (mRNA)、miRNA、长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)等均可充当HCC筛查和监测的生物标志物。由AFP和外泌体miRNA-10b、miRNA-21、miRNA-122及miRNA-200a构成的组合被认为是一种早期诊断HCC(AUC=0.993)更好的策略[24]。HCC患者血清外泌体miRNA-18a、miRNA-221、miRNA-222及miRNA-224水平明显高于CHB和肝硬化患者，但HCC患者血清相关miRNA水平与CHB和肝硬化患者相比差异较小。因此，血清外泌体miRNA能更好地用于HCC的诊断及预后评估[25]。此外，HCC患者血清外泌体lncRNA ENSG00000258332.1和LINC00635水平也显著高于肝硬化、CHB患者和健康受试者[26]。用这两种lncRNA和AFP组合筛查CHB中的HCC比单独使用AFP检测具有更高的敏感度和特异度。Xu等[27]通过检测HCC、肝硬化和CHB患者以及健康受试者血清外泌体异型核糖核蛋白H1 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1, hnRNPH1)mRNA的相对表达水平，发现用外泌体hnRNPH1 mRNA筛查CHB中的HCC(AUC=0.865)，敏感度和特异度分别可达85.2%和76.5%，特别是与AFP(≥20 ng/ml)联合使用可进一步提高诊断效能。

3 潜在的生物标志物

3.1 微小RNA(miRNA) 理想的HCC生物标志物应有高敏感度及特异度，检测费用少且无创，并能够在易于获取的组织(如血清、血浆、尿液、唾液等)中进行评估。miRNA具有高度稳定性且以无细胞形式在血液甚至唾液中循环，可作为潜在的较少侵入性或非侵入性生物标志物[28]。早先有研究[29]证实，血清miRNA-122是一种肝特异性miRNA，用其作为区分HCC患者和健康者的生物标志物(AUC=0.869)，灵敏度和特异度分别为81.6%和83.3%，故可作为一种诊断HCC的潜在标志物。另外，血清miRNA-16、miRNA-195、miRNA-199a、miRNA-143和miRNA-215也都可作为区分HCC患者和健康个体的重要生物标志物，具有良好的敏感度和特异度[30]。

由于HCC是一种复杂的、具有多致病因素和高度异质性的疾病，在其发生和发展过程中出现许多miRNA表达失调。因此，多个循环miRNA组合检测能够提供更高的特异度和敏感度，可作为HCC早期诊断的生物标志物。研究[31]表明，7个血浆miRNA(miRNA-122、miRNA-192、miRNA-21、miRNA-223、miRNA-26a、miRNA-27a和miRNA-801)组合可区分HCC与健康个体(AUC=0.941)、CHB(AUC=0.842)和肝硬化患者(AUC=0.884)，能显著提高HCC诊断准确性，在诊断早期HCC中具有重要临床价值。Jin等[32]研究发现，HCC患者相比正常对照组有12种血浆miRNA表达始终上调，其中4种(miRNA-1972、miRNA-193a-5p、miRNA-214-3p和miRNA-365a-3p)明显增加，但在非HCC患者中未见显著升高，故可作为诊断HCC的生物标志物，其中miR-1972的诊断性能最佳，具有良好的潜在应用价值。An等[33]还发现一组可作为诊断HCC潜在生物标志物，即血清miR-375、miR-10a、miR-122和miR-423，AUC为0.995(95%CI：0.985～1)。

3.2 长链非编码(lncRNA) 与其他肿瘤生物标志物相比，lncRNA具有时间和组织特异性表达模式，可为临床上区分患者和健康个体提供新的标记。因此，lncRNA有望成为诊断癌症的潜在生物标志物[34-35]。关于lncRNA CDKN1A反义DNA损伤激动RNA启动子 (promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA, PANDAR)、尿路上皮癌相关因子1 (urothelial carcinoma associated 1, UCA1)、浆细胞瘤多样异位基因1 (plasmacytoma variant translocation gene 1, PVT1)、HOX转录反义RNA (HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)在HCC早期诊断中的潜在价值已有相关研究报道[36]。一项纳入80例HCC患者及同期50例健康受试者的对照研究[37]发现，HCC患者血清lncRNA癌症易感性候选物9(cancer susceptibility candidate 9, CASC9)表达水平明显增加，AUC为0.933。而CASC9能否成为诊断HCC的潜在标志物，关键在于其能否区分开HCC与肝炎，目前尚不清楚，还需进一步研究。Qi等[38]研究发现，HBV HCC患者血清lncRNA反义胰岛素样生长因子2 (insulin growth factor 2 antisense, IGF2AS)水平明显高于健康受试者、慢性HBV和HBV相关性肝硬化患者，而且AFP阴性HCC患者和AFP阳性HCC患者血清IGF2AS水平均较HBV相关性肝硬化患者升高，提示血清IGF2AS可能是诊断HBV-HCC的一个潜在生物标志物。李双良等[39]研究显示，lncRNA HOTAIR、H19和肝癌高度上调因子(highly upregulated in liver cancer, HULC)可作为诊断早期HBV-HCC的潜在标志物，这三种lncRNA联合诊断HCC的敏感度为91.67%，特异度为93.33%。

4 总结与展望

质谱和下一代测序等技术的进步为鉴定HCC早期诊断的生物标志物带来了广阔的前景和挑战。首先，循环miRNA作为一类全新的生物标志物，其敏感性优于传统的血清蛋白标志物。由于体液中miRNA的某些变化在HCC早期就已较为明显，因此便于监测筛查早期HCC的发生。但是，体液中miRNA的变化可能会出现基于人群的差异，因此应在大规模的临床研究中验证其作为生物标志物的能力。其次，外泌体囊泡中所含的蛋白质、核酸和其他物质存在于相对独立的特殊环境中，比自由存在于组织或体液中的肿瘤标志物具有更高的稳定性和丰度。但目前关于外泌体的鉴定、分离和纯化技术不成熟，分子机制不完全清楚以及外泌体的人工合成技术尚不成熟，因此，关于外泌体在HCC诊断方面的许多研究仍处于临床前的实验阶段。此外，lncRNA是近年来HCC研究领域一个新的热点，但在其成为可用于临床的生物标志物之前，还需要进行大量的深入研究。总之，尽管有这些限制，但通过对这些新型的生物标志物的研究，不仅可对HCC诊断提供重要的线索，而且还可为发掘出更好的治疗策略开辟新的思路。

作者贡献声明：刘熙称负责课题设计，撰写论文；刘熙称、王艺颖、童曼曼参与文献搜集，修改论文；秦俊杰负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。