纸桥法液体培养基替代琼脂固体培养基用于食用菌菌种培养的初步探索

栗志

摘    要：本文设计了一种使用纸桥法培养常见食用菌菌种（平菇、香菇、金针菇）的方案，并通过试验得出如下结论：相对于琼脂固体培养基，平菇、香菇、金针菇的菌丝体在纸桥法液体培养基上均表现出更高的生长速率，而且纸桥法液体培养基在营养物质传质速率方面存在显著的优势，尤其适用于试验教学，是琼脂固体培养基的良好替代品。

关键词：纸桥法;液体培养基;菌种培养

文章編号：1005-2690（2021）20-0017-02       中国图书分类号：S646       文献标志码：B

纸桥法是传统上用于植物组织培养的一种技术[1]，由于植物培养物对矿物盐浓度较为敏感，琼脂中额外的矿物质可能对植物培养物产生影响，故采用无灰滤纸制作的纸桥来确保培养物在不受到额外矿物质影响的情况下，也能够给同时得到充分的氧气、水分和营养物质供应[2]，另有原理和纸桥法类似的培养床网绒纤维用于愈伤组织液体培养基的传质[3]。

实验室规模的食用菌菌种培养一般采用PDA琼脂固体培养基，相对于植物固体培养基的琼脂浓度（一般低于1%），真菌固体培养基的琼脂浓度（一般为2%）要高得多。琼脂浓度越高，其分子构筑起的三维网状凝胶结构的强度越大，这有助于固体培养基保持一定的强度和形状，但也对培养基中营养物质的迁移速率（即传质速率）存在影响。以PDA培养基中的主要碳源和能源——葡萄糖为例，研究表明，琼脂浓度的升高会造成葡萄糖的迁移速率减慢[4]。另有研究者发现由于存在传质阻力，琼脂浓度的增加会造成木葡糖酸醋杆菌的葡萄糖利用率、菌体量和细菌纤维素产量下降[5]。

尝试用无灰滤纸制造的纸桥进行实验室规模食用菌菌种培育，和相同营养成分的琼脂固体培养基进行对照。根据菌种的生长速率和培养基中可溶性固形物（对应营养物质）的浓度变化来对比两者培养方法的优劣。

选用食用菌均为常见物种，即平菇、香菇、金针菇。

1   试验准备

1.1   试验材料

平菇（Pleurotus ostreatus）纯培养菌种，品系为高邮3号;香菇（Lentinus edodes）纯培养菌种，品系为L808;金针菇（Flammulina  velutiper）纯培养菌种，品系为245号。

1.2   试验设备及试剂

设备：人工气候箱、干燥箱、高压灭菌锅、微孔滤膜透气盖和配套的螺口方玻璃瓶、解剖刀、镊子、烧杯、量筒、电子天平、称量纸、酒精灯、超净工作台、无灰滤纸。

试剂：新鲜的马铃薯葡萄糖液体培养基（PDA）、去离子水、琼脂粉。

2   试验过程

将微孔滤膜透气盖和配套的螺口方玻璃瓶（横截面积约为80 cm2）依照如下规则进行分组编号并处理。

琼脂试验组：加入螺口方瓶总容积1/4体积的PDA液体培养基和液体培养基重量2%的琼脂粉，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却凝固后分别接种香菇纯培养菌种、平菇纯培养菌种、金针菇纯培养菌种，每个菌种接种不少于4瓶，25 ℃、70%湿度黑暗培养。

纸桥试验组：加入螺口方瓶总容积1/4体积的PDA液体培养基和无灰滤纸制造的纸桥，纸桥上表面尽可能和螺口方瓶横截面大小、形状一致，液面高度超过纸桥高度的2/3，保证整个纸桥被液体培养基所浸润，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却至常温后分别接种香菇纯培养菌种、平菇纯培养菌种、金针菇纯培养菌种，每个菌种接种不少于4瓶，25 ℃、70%湿度黑暗培养。

琼脂对照组：加入组培瓶总容积1/4体积的PDA液体培养基和液体培养基重量2%的琼脂粉，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却凝固后置于25 ℃、70%湿度黑暗条件下。

纸桥对照组：加入螺口方瓶总容积1/4体积的PDA液体培养基和无灰滤纸制造的纸桥，液面高度超过纸桥高度的2/3，保证整个纸桥被液体培养基所浸润，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却至常温后置于25 ℃、70%湿度黑暗条件下。

琼脂空白组：加入组培瓶总容积1/4体积的去离子水和液体重量2%的琼脂粉，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min，冷却凝固后置于25 ℃、70%湿度黑暗条件下。

试验过程中保持较高的湿度，一是模拟菌丝体最适宜生长的环境，二是通过提高水蒸气分压来减少培养基水分蒸发引起的误差。琼脂空白组的存在意义在于抵消琼脂凝胶上层、下层琼脂浓度不同造成的误差。

每3 d记录菌丝体在琼脂试验组和纸桥试验组培养基上的生长状况，30 d后对培养基取样，在110 ℃干燥箱烘干至恒重，根据烘干后重量和烘干前重量的比值，计算出琼脂试验组、琼脂对照组、琼脂空白组上半层、下半层，以及纸桥试验组和纸桥对照组液体培养基表层和深层的可溶性固形物含量。

3   试验结果

3.1   菌丝体生长速率量化分析

对培养物进行拍照，将照片上纸桥上表面和琼脂固体培养基表面划分为5×5的25个小方格，最初接种的菌丝体大小控制在一个小方格左右，随着时间推移，菌丝体不断生长、扩散，覆盖了越来越多的面积。利用小方格对菌丝体覆盖面积进行计数，接近或略多于一个小方格全部面积的计为4%，接近或略多于一个小方格1/2面积的记为2%，覆盖极少或根本没有覆盖一个小方格面积的记为0%。对菌丝体所占小方格的数量进行累加，即可判断菌丝体的大小和生长速率。

经过实测得到的3种食用菌菌丝体在纸桥和琼脂表面的生长曲线（试验组取平均值），其斜率即为生长速率，如图1所示。

3.2   可溶性固形物含量分析

由于琼脂培养基中的可溶性固形物数据包含琼脂，所以需要将琼脂空白组的可溶性固形物含量减去再作为有效数据。纸桥法有少量菌丝体蔓延到溶液中形成悬液，所以取样后先过滤除去菌丝体再进行测定。

根据实测数据做出的30 d后平菇、香菇、金针菇培养基上（表）层/下（深）层可溶性固形物含量对比（试验组取平均值，单位为%）结果如下。

琼脂对照组：2.51/2.53，平菇琼脂培养基：1.24/ 2.03，香菇琼脂培养基：1.44/2.23，金针菇琼脂培养基：1.34/2.09;纸桥法对照组：2.57/2.58，平菇紙桥法：1.56/1.58，香菇纸桥法：1.71/1.72，金针菇纸桥法：1.66/1.67。

4   结论与分析

平菇、香菇、金针菇菌丝体在纸桥法液体培养基上的生长速率普遍高于各自在琼脂固体培养基上的生长速率，即菌丝体需要较短的时间即可占领同样面积的培养基，这种特性适合在实验室中进行教学，学生可以在较短的时间内完成食用菌菌种培养的全过程。

平菇、香菇、金针菇菌种接种30 d后，琼脂培养基上半部分的可溶性固形物（不包括琼脂）含量显著低于琼脂固体培养基下半部分的可溶性固形物（不包括琼脂）含量，而纸桥法液体培养基表层和深层的可溶性固形物含量十分接近，这一现象很好地表述出固体培养基在营养物质迁移速率上与液体培养基存在差距。用纸桥法培育食用菌菌种可以充分利用液体培养基中营养物质较高的迁移速率，让菌丝体得到更为充足的营养供应，不容易出现短缺现象，这可能是其表现出更高生长速率的原因之一。

纸桥法液体培养基为菌种培养提供了一条有效的新思路，但其具体参数的优化，以及在规模上如何进一步扩大，从试验室走向生产，仍需要更多的研究工作。

参考文献：

[1]于德才，李学湛，吕典秋，等.纸桥法培育马铃薯脱毒试管苗壮苗技术初探[A]. 中国作物学会马铃薯专业委员会.2005年全国马铃薯产业学术年会论文集[C].中国作物学会马铃薯专业委员会：中国作物学会马铃薯专业委员会，2005：2.

[2]安利国，杨桂文.细胞工程（3版）[M].北京：科学出版社，2015.

[3]周春长.影响植物纤维模拟生物反应器渗透浸润传质MS培养液过程的因素[D].吉首：吉首大学，2020.

[4]边界，何田，叶微针，等.葡萄糖在琼脂凝胶中的迁移速率[J].广东化工，2021，48（7）：50-51.

[5]谢永振.静置培养过程中琼脂浓度对细菌纤维素合成的影响[D].天津：天津科技大学，2018.

（编辑：郝焕霞）