黑皮油松松针精油纳米乳液的制备及稳定性研究

王雪薇 李德海

(东北林业大学 林学院/黑龙江省森林食品资源利用重点实验室，哈尔滨 150040)

黑皮油松(Pinustabuliformisvar.mukdensis)，是松杉目、松科和松属常绿乔木[1]，主要分布于中国河北省、辽宁省和黑龙江省等地。黑皮油松精油(Essential oil ofP.tabulaeformisneedles, EOPTN)是最重要的松类副产品，主要从松针中提取，具有特殊的芳香气味、抑菌能力强和抗氧化等性能，因此作为天然的抑菌剂被应用于食品行业中[2]。但黑皮油松松针精油和其他精油一样，易挥发，对光和热高敏感，水溶性差[3]，导致在应用时受到限制。

近年来纳米乳化技术在解决精油水溶性及稳定性等问题上取得了显著效果[4]。通过纳米乳化技术制备的纳米乳液(Nanoemulsion)是1类粒径大小为10～100 nm的胶体分散系统，是1种均匀且呈透明或半透明状的液体[5],可有效提高精油等脂溶性物质的溶解度。目前已有研究表明，使用表面活性剂和助表面活性剂制备的纳米乳液可提高精油的溶解性、稳定性和生物活性[6]。在纳米乳液制备中表面活性剂和助表面活性剂的使用可以减少界面张力，加快精油的亲脂性成分快速分散到食品体系中，提高了精油纳米乳液的稳定性。Adel等[7]研究发现橘皮精油纳米乳化后由于使用表面活性剂和助表面活性剂提高了精油的溶解性；张培旗等[8]利用高压微射流制备的生姜纳米乳液稳定性好，可以延长酱油的货架期，储存28 d酱油未出现聚沉现象。此外，纳米乳液分散性好、稳定性强和渗透力高的特点可以提高精油的利用率[9]。Nazia等[10]在制备百里香精油纳米乳液时发现乳化包埋技术可以提高精油的生物活性从而提高精油的利用率。

本研究采用吐温(Tween)和聚氧乙烯蓖麻油(Crempphor)作为表面活性剂，采用无水乙醇、正丁醇和丙三醇作为助表面活性剂制备黑皮油松松针精油纳米乳液，测定其纳米乳液的形态、粒径、分布情况和稳定性,研究制备黑皮油松松针精油纳米乳液稳定性高和抑菌性强的最佳配方，以期在实际生产和生活中提高黑皮油松松针精油的利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑皮油松松针于2019年5月采摘于东北林业大学帽儿山林场，将新鲜松针晾干粉碎后过60目筛，置于常温下保存；大肠杆菌(EscherichiacoliATCC25922)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureusrosen bach ATCC6538)来自于东北林业大学黑龙江省森林食品资源利用重点实验室。

无水乙醇(化学纯)、正丁醇(化学纯)、丙三醇(化学纯)、Tween 80(化学纯)、聚氧乙烯蓖麻油(化学纯)和肉膏蛋白胨培养基，购自天津致远化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

蒸汽灭菌锅(申安，上海)；摇摆式高速万能粉碎机(林大，温岭)；电子天平(丹佛，上海)；电热恒温转风干燥箱(恒科，上海)；UV-1750紫外可见分光光度计(岛津，日本)；旋涡混合仪(达姆，上海)；M-110动态高压微射流(Microfluidic，美国)；ZetasizerNano-ZS90 纳米粒度仪(耐克特，山东)；透射电子显微镜(徕卡，德国)。

1.3 方法

1.3.1黑皮油松松针精油的制备

黑皮油松松针精油提取采用水蒸气蒸馏法，以宗芳芳等[11]的方法为参照。准确称取黑皮油松松针粉末50.00 g，装入1 000 mL的圆底烧瓶中，按照料液比1∶6(g/mL)加入300 mL蒸馏水，每50.00 g粉末中加入0.25 g NaCl，8 h后停止蒸馏，所得精油置于4 ℃条件下保存。

1.3.2黑皮油松松针精油纳米乳液的制备

将一定质量的表面活性剂加入到精油中，通过旋涡混合仪震荡混匀后，所得到的乳液于120 MPa压力下经微射流处理3次,即可得到纳米乳液，经过一段时间静置，通过分层体积来判断其稳定性。在制备过程中，通过改变表面活性剂、助表面活性剂以及复配比例以获得不同的乳液。选择Cremophor EL(Cremophor EL 20、Cremophor EL 30和Cremophor EL 40)和Tween(Tween 40、Tween 60和Tween 80)2个系列作为表面活性剂的筛选，然后选择较为温和的无水乙醇、正丁醇和丙三醇作为助表面活性剂的筛选。通过判断分层体积确定质量比(Km=5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1和1∶2)，最后通过对复合表面活性剂与油的比值(S/O值=9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8和1∶9)，进行伪三元相图的绘制。

1.3.2.1 表面活性剂的筛选

参考王鲁慧等[12]的方法进行修改。取1号、2号和3号带刻度试管，先在3支试管中各加入1.00 g 精油和0.60 g的无水乙醇，然后在1号试管中加入0.15 g Cremophor EL，在2号试管中加入0.15 g Tween，在3号试管中加入0.15 g复合表面活性剂m(Cremophor EL)∶m(Tween)=1∶1，最后加蒸馏水定量至3 mL。将所得乳液用旋涡混合仪震荡混匀，再经微射流处理后分别静置5、10、30和60 min，观察并记录体系分层后下层清液的体积并绘制三元相图，依分层体积和三元相图的乳化区面积判定其稳定性。

1.3.2.2 助表面活性剂的筛选

表面活性剂与助表面活性剂按照质量比4∶1混匀后作为复合表面活性剂，并进行稳定性判定，从而确定最适助表面活性剂。亲水亲油平衡值(HLB值)的测定：将表面活性剂复配使用时，复配体系的HLB值具有加和性，复合表面活性剂的HLB值根据下面公式进行计算。当表面活性剂HLB值与油相HLB值较为接近时，乳化效果较好。

HLBMIX=(HLBC×wC+HLBT×wT)/
(wC+wT)

式中：HLBC和HLBT为表面活性剂Cremophor EL和Tween的HLB值；wC和wT为表面活性剂Cremophor EL和Tween的质量分数，%。

1.3.2.3 表面活性剂与助表面活性剂配比(Km)的确定

将最终筛选出的表面活性剂和助表面活性剂按质量比混匀后，作为复合表面活性剂。按照1.3.2.1的方法制备精油乳液并记录其分层体积，计算乳化区面积判定其稳定性，从而确定最佳Km值。

1.3.2.4 纳米乳液最佳制备条件伪三元相图的绘制

以黑皮油松松针精油作为油相，将油相与混合表面活性剂按照比例混匀，制备出9种不同S/O值的混合溶液；分别取10 mL置于三角瓶中，室温下用旋涡混合器一边震荡一边滴加蒸馏水，使其混合均匀，期间会出现溶液由澄清变浑浊现象，继续滴加蒸馏水，直至溶液由浑浊变澄清，且状态不再发生变化。记录临界点时加入蒸馏水的体积，同时计算溶液中其它物质在该临界点时的质量分数。用Origin 9.0绘制纳米乳化区域。

1.3.3纳米乳液的表征

1.3.3.1 纳米乳液的判定

纳米乳液的形成判定标准：第一，松针精油纳米乳化后形成的溶液是否澄清透明；第二，是否有蓝色或淡蓝色乳光；第三，平行光入射后是否产生丁达尔效应。

1.3.3.2 纳米乳液类型的测定

判定乳液类型的方法：向乳液中同时滴加水溶性染料亚甲基蓝和油溶性染料苏丹红III，若苏丹红III染料在乳液中的扩散速度快于亚甲基蓝染料，则为油包水型(W/O)乳液，反之为水包油型(O/W)乳液，若苏丹红III染料和亚甲基蓝染料在乳液中的扩散速度一样则为双连续型纳米乳液。

1.3.3.3 纳米乳液的形态、粒径以及多分散项系数(PDI)分析

取适量的精油纳米乳液样品，在透射电镜下观察纳米乳液滴的形态。用ZetasizerNano-ZS 90纳米粒度测定样品中粒子粒度及粒度分布。He/Ne激光器的散射角为173°，波长为633 nm。将约1.2 mL 的待测样品装入聚苯乙烯比色皿中，测试温度设定为(25.0±0.1) ℃，平衡时间设为2 min，每个样品重复测定3次。但在乳液粒径测定时，为避免多重散射的影响，静置待样品池中气泡消除后，乳液均经去离子水稀释50倍再进行测定。粒径大小及多分散项系数分别以d(Diameter，nm)和PDI(Polydispersity index)表示。

1.3.4黑皮油松松针精油纳米乳液的稳定性

1.3.4.1 储藏稳定性

将纳米乳液样品置于室温条件下储藏，分别在储藏的第10、20、30、40、50和60天，采用1.3.3.3的方法测定纳米乳液的粒径和PDI变化。

1.3.4.2 pH稳定性

将制备好的纳米乳液分装于试管中，使用1 mol/L NaOH或者1 mol/L HCl溶液调节pH至3、4、5、6、7、8和9，在室温放置过夜，稀释100倍后，测定纳米乳液的粒径和PDI变化。

1.3.4.3 温度稳定性

取10 mL纳米乳液于试管中，分别在40、50、60、70、80、90和100 ℃下水浴保温60 min，室温放置过夜，稀释100倍后，测定纳米乳液的粒径和PDI变化。

1.3.4.4 黑皮油松松针精油纳米乳液的抑菌性

采用二倍稀释法测定黑皮油松松针精油及其纳米乳液的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，对其抑菌活性进行定量分析。将试管灭菌，进行编号，配制一系列梯度的纳米乳液溶液，加入液体培养基使总体积为4 mL，保持最终纳米乳液体积分数范围在0.125～0.128 μL/mL，每个试管中再加入50 μL菌悬液，恒温震荡培养1 h；从试管中取50 μL涂布在平板上，密封培养24 h或48 h后拿出，观察各浓度培养皿上是否有菌生长。MIC值为培养24 h不长细菌时的纳米乳液浓度，MBC值为培养48 h不长细菌时的纳米乳液浓度。

1.4 数据处理

每组数据均平行检测3次，结果取平均值。基础数据采用Excel软件处理，其余采用Origin 9.0处理，采用SPSS 21.0软件对显著性进行分析。

2 结果与分析

2.1 黑皮油松松针精油纳米乳化体系的研究

2.1.1表面活性剂的筛选

经过预实验选择出了Tween 80和Cremophor EL 40作为制备松针精油纳米乳液表面活性剂的首选，其余均不能形成稳定的乳化体系。3种表面活性剂的HLB值及乳化效果见表1。由表1可知，3种纳米乳化体系的分层体积随着静置时间的增加而增加。经过60 min的静置，以Tween 80为表面活性剂制备的纳米乳液分层体积最少(0.5 mL),且乳化区面积最大(25.504%)；以Cremophor EL 40为表面活性剂制备的纳米乳液分层体积为0.8 mL，乳化区面积为21.500%；以Cremophor EL40和Tween 80复配的表面活性剂制备的纳米乳液分层体积为1.0 mL，乳化区面积为11.622%，小于单一表面活性剂的乳化区面积。这说明表面活性剂的两两复配并没有产生协同效应，未能达到提高纳米乳液稳定性的效果。复配表面活性剂之间可以产生协同作用主要有2个原因：一是多种表面活性剂可以提高乳化体系对水的增溶能力；二是表面活性剂分子通过分开界面增大了界面面积[13]。这2种复配表面活性剂乳化能力的降低可能是因为紧密结合的2种基团降低了表面活性剂亲水性能力。综上，选择Tween 80作为制备黑皮油松松针精油纳米乳液的表面活性剂。

表1 不同静置时间下表面活性剂对黑皮油松松针精油乳化效果的影响Table 1 Effect of surfactants on emulsification of essential oil ofPinus tabulaeformis needles under different standing time

2.1.2助表面活性剂的筛选

不同助表面活性剂对黑皮油松松针精油乳化效果的影响见表2。3种纳米乳液经过60 min的静置，以无水乙醇为助表面活性剂的纳米乳液分层体积为0.3 mL,乳化区面积为25.504%，而正丁醇和丙三醇的乳化区面积小于无水乙醇的乳化区面积。Dun等[14]认为在水-油-表面活性剂-助表面活性剂共同形成的复杂体系中，2种活性剂首先混合形成双层膜，然后在油水界面上吸附。双层膜可以在油水界面弯曲，弯曲程度和方向的不同，纳米乳液的类型也不同。因此，在乳液形成过程中，2种活性剂的种类和添加量是重要的考虑因素。无水乙醇和Tween 80可以形成具有良好柔韧性的双层膜并稳固的吸附在油水界面上。综上，选择无水乙醇作为制备黑皮油松松针精油纳米乳液的助表面活性剂。

2.1.3助表面活性剂与表面活性剂配比(Km)的确定

不同的Km值会影响纳米乳液的稳定性即分层体积和乳化区面积。当乳化体系的Km值一定，乳化体系的分层体积会随着时间的增长而增加，这说明稳定性会逐渐降低。当Km值为4∶1时，静置60 min后分层体积最小且乳化区面积最大(表3)。其原因可能是当Km合适时，界面膜的弯曲弹性增加，表面张力增大，促进乳化体系的形成[15]。综上，选择Km为4∶1即m(无水乙醇)∶m(Tween 80)=4∶1，制备黑皮油松松针精油纳米乳液。

表2 不同静置时间下助表面活性剂对黑皮油松松针精油乳化效果的影响Table 2 Effect of consurfactants on emulsification of essential oil ofP.tabulaeformis needles under different standing time

表3 不同静置时间下Km对黑皮油松松针精油乳化效果的影响Table 3 Effect of Km on emulsification of essential oil of P.tabulaeformisneedles under different standing time

2.1.4纳米乳液最佳制备条件

对复合表面活性剂与油的比值(S/O值=9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8和1∶9)进行三元相图的绘制(图1)。三元相图中阴影面积为纳米乳化区，3条边分别表示了纳米乳液中复合表面活性剂、精油和水的含量即3种物质在纳米乳液中所占百分比，图中黑点表示S/O的值。在伪三元相图中，通过Origin软件自动选取纳米乳化区面积中央的1点即为纳米乳液的最佳配方(ME)，将ME点所在位置分别向三条边延长所对应的3项值即松针精油16.14%、复合表面活性剂10.45%和蒸馏水73.41%为纳米乳液最佳配方。

2.2 纳米乳液的表征

2.2.1纳米乳液的判定

由图2(a)可见，纳米乳液澄清透明，有微弱的淡蓝色光，且乳液可以与水以任意比例混合。胶体产生丁达尔效应的原因是入射光的波长>胶体粒子直径。由图(b)可见，经过平行光入射后有丁达尔效应发生，由清晰的红色射线可知所制备的纳米乳液外观均一、透明且性质稳定。综上，该制备方法可形成纳米乳液。

2.2.2纳米乳液类型的测定

通过染色法鉴定精油纳米乳液的类型，向纳米乳液中同时滴加油溶性染料苏丹红III和水溶性染料亚甲基蓝,亚甲基蓝在乳液中的扩散速度明显快于苏丹红III,由此可判定所制备的乳液为O/W型纳米乳液。

图中黑点表示S/O的值。ME为软件自动选取的纳米乳液最佳配方。彩线表示纳米乳液最佳配方对应的每种成分的最佳含量。The black dot in the figure represents the value of S/O. ME is the best formulation of nano emulsion for automatic selection of software. Color line represents the best content of each component in the best formula of nano emulsion.图1 黑皮油松松针精油纳米乳液最佳制备条件的伪三元相图Fig.1 Pseudo three phase diagram of optimum preparation conditions for Pinus tabulaeformis needles essential oil nanoemulsion

图2 黑皮油松松针精油纳米乳液的外观(a)和丁达尔效应(b)Fig.2 The appearance (a) and Dindal effect (b) of P.tabulaeformis needles essential oil nanoemulsion

图3 苏丹红III(左)和甲基蓝(右)在纳米乳液中扩散情况Fig.3 Diffusion of sudan III (left) and methyl blue (right) in nanoemulsion of EOPTN

2.2.3纳米乳液的形态、粒径以及分布

将松针精油纳米乳液经过50倍稀释后，通过透射电子显微镜观察到其液滴形态(图4)。在显微镜下可以直观的观察到纳米颗粒的形状和分布。松针精油纳米乳液滴呈现球圆形，并且分布均匀，说明此纳米乳液分散较好。

图4 黑皮油松松针精油纳米乳液透射电镜照片Fig.4 Transmission electron micrograph of nanoemulsion of EOPTN

粒径的大小不仅可以评判纳米乳液是否形成，而且也是衡量纳米乳液稳定性好坏的标准。采用纳米粒度仪测定所制备纳米乳液的粒径分布如图5，可以看出松针精油纳米乳液滴的粒径分布窄且呈单峰，说明液滴粒径一致性好。经纳米粒度检测报告显示平均粒径在35 nm，PDI为0.165。有研究表明当PDI<0.300时，纳米乳液较稳定[16]。综上，纳米乳液有较好的品质。

图5 黑皮油松松针精油纳米乳液粒径分布图Fig.5 The droplet-size distribution curve for nanoemulsion of EOPTN

2.2.4纳米乳液的稳定性

2.2.4.1 黑皮油松松针精油纳米乳液的储藏稳定性

由图6可知，在储藏30 d时，纳米乳液的PDI与第0天相比增加0.013，但粒径仅增大5 nm，说明在30 d内，纳米乳液保持较好的流动性和一定的透明度。当储藏天数继续增加，PDI开始波动明显，与第0天相比增加0.065，粒径增加10 nm。在储藏至60 d时，纳米乳液未发生水油分离和絮凝等现象。综上，本研究制备的纳米乳液在60 d之内有良好的储藏稳定性，且最佳储藏时间为30 d。

不同大写字母表示PDI差异显著(P<0.05)；不同小写字母表示平均粒径差异显著(P<0.05)。下同。Different capital letters indicated significant difference in PDI (P<0.05), and different lowercase letters indicated significant difference in average particle size (P<0.05).The same below.图6 黑皮油松松针精油纳米乳液平均粒径和PDI变化Fig.6 Changes in the mean droplet size and PDI for nanoemulsion of EOPTN

2.2.4.2 黑皮油松松针精油纳米乳液的pH稳定性

由图7可知，pH<7或>7时，纳米乳液的粒径和PDI均有小幅增加；pH=7时，粒径和PDI最小。当pH在3～9时，纳米乳液的粒径仅变化4 nm，PDI变化0.024，属正常范围[21]。因此，本研究制备的纳米乳液有良好的pH稳定性。

图7 pH对黑皮油松松针精油纳米乳液的平均粒径和PDI的影响Fig.7 Effect of pH value on the average size and PDI of nanoemulsion of EOPTN

2.2.4.3 黑皮油松松针精油纳米乳液的温度稳定性

由图8可知，当温度低于70 ℃时，纳米乳液的粒径在35～40 nm，PDI变化幅度小，纳米乳液仍然保持澄清透明略带蓝光的状态；在加热到80 ℃时，纳米乳液的粒径增幅变大，PDI急速上升，此时纳米乳液开始出现浑浊现象，说明此时起昙现象出现；将已经浑浊的乳液置于室温中冷却，又恢复到之前澄清透明的状态。综上，本研究制备的纳米乳液体系具有良好的温度稳定性，昙点温度为80 ℃左右。

图8 温度对黑皮油松松针精油纳米乳液的平均粒径和PDI的影响Fig.8 Effect of temperature on the average size and PDI of nanoemulsion of EOPTN

2.2.4.4 黑皮油松松针精油纳米乳液的抑菌效果研究

由表4可知，未乳化的精油和其纳米乳液对测试菌均有抑制效果，黑皮油松松针精油对E.coil的MIC为1.6 μL/mL，MBC为3.2 μL/mL，对S.aureus的MIC为3.2 μL/mL，MBC为6.4 μL/mL；但是其纳米乳液体系对2种测试菌抑制效果优于未乳化的精油抑菌效果，对E.coil和S.aureus的MIC分别为0.8和1.6 μL/mL，MBC分别为1.6和3.2 μL/mL。

在相同的精油浓度以及其他外界因素一致的情况下，精油纳米乳液对2种供试菌抑菌效果均比精油抑菌效果好。这可能是因为纳米乳液通过运输活性物质，精油在水中的溶解性和稳定性均明显提升，增加了分散性，提高了比表面积，并且可以与细菌细胞膜相互作用导致细胞裂解。Donsì等[17]研究表明将萜烯混合物和d-柠檬烯混合封装于食品级配料的纳米乳液，对大肠杆菌抗菌活性的增加主要取决于表面活性剂和输送系统的平均直径。当纳米乳液和输送系统的直径相似时，细胞出现被动吸收现象，从而减小了阻力，梨汁中加入纳米级的萜烯后，可以保护梨汁的品质不被破坏。由此可见，经过纳米乳化后的精油体系抑菌效果更好，可能是因为纳米乳液粒径较小，更易破坏细菌细胞膜，增强了乳化体系的抑菌效果。

表4 黑皮油松松针精油纳米乳液的最小抑菌浓度和最低抑菌浓度Table 4 MIC and MBC of EOPTN nanoemulsion μL/mL

3 讨 论

3.1 对前人研究结果有所突破、创新的阐释

本研究通过分层体积和三元相图的乳化区面积2种指标来筛选表面活性剂和助表面活性剂以及两者配比，制备了稳定的黑皮油松松针精油纳米乳液。周汉军[18]对桉叶精油的乳化体系进行了研究，只以分层体积作为筛选的指标，发现Cremophor系列更适合制备桉叶精油的乳化体系；陶紫[19]在香茅草精油微乳体系的构建中，利用伪三元相图的微乳区面积发现Tween 80具有更好的乳化效果。这说明不同来源的精油在构建乳化体系的时候，最适表面活性剂和助表面活性剂的选择也不同。目前对乳化体系配方的筛选有分层体积和伪三元相图的乳化区面积等，本研究将2种指标相结合使实验更具说服性。是否还有其他判定纳米乳液体系的配方指标将是下一步研究的重点。

3.2 研究需要说明的问题及前沿展望

黑皮油松是松科松属植物中比较容易获得的树种，资源丰富，且它的松壳和松果等已被国内外学者证实具有很多活性成分，因此其开发的安全性和可行性都比较高。研究表明黑皮油松松针精油具有良好的抑菌活性和抗氧化作用，但是由于不溶于水且活性成分易挥发限制了其开发利用。本研究将黑皮油松松针精油制备成黑皮油松松针精油纳米乳液，试验结果表明此纳米乳液与未经乳化的精油相比稳定性和抑菌性都得到了一定的提高。但在此试验中只研究了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，在实际应用中会涉及到其他的菌如白色念珠菌(Candidaalbicans)。在之后的试验中会继续研究黑皮油松松针精油纳米乳液对其他菌种的抑菌效果，使试验更具有广泛性和严谨性。据报道，精油的抑菌机理主要包含细胞壁和细胞膜结构的破坏、胞体脂肪体的溶解、细胞膜正常功能的紊乱、对DNA和RNA 等遗传物质的合成抑制、对脂质层的稳定的影响等和对能量代谢及还原酶体系的影响[20]。Michael等[21]对精油中的主要成分萜类化合物进行了研究，结果表明，该萜类化合物在NADH即还原型辅酶辅因子的使用和反应收率方面是高效的，并对电子传递也有一定影响。因此黑皮油松松针精油纳米乳液的抗菌机理有待进一步研究和总结。本研究解决了黑皮油松松针精油水溶性差、利用率低、储藏和加工过程中易发生氧化变质等加工、贮藏和应用方面的难题，在保证黑皮油松松针精油活性成分不损失的同时，扩大了其作为天然抑菌剂等功能性辅料在食品领域的应用范围。

4 结 论

本研究得到制备黑皮油松松针精油纳米乳液的最佳配方为松针精油16.14%、复合表面活性剂10.45%(m(无水乙醇)∶m(Tween 80)=4∶1)和蒸馏水73.41%，制备的纳米乳液粒径平均为35 nm，PDI为0.165，具有良好的稳定性和抑菌性。