陈 嵘 林小红 黎 云 周宇恒
广东省妇幼保健院(广州,511400)
子痫前期合并胎儿生长受限(FGR)是导致不良妊娠结局的重要风险因素,其中早发型重度子痫前期(EOSP)合并FGR的发生率为10%~70%,严重影响胎儿后期生长发育[1-2]。引起FGR的因素有多种,胎盘发育和功能障碍是其中因素之一。研究表明,微小RNA(miRNA)在妊娠期高血压、子痫前期等疾病中异常表达,与患者预后相关[3]。miR-221是miRNA之一,miR-221可通过下调凋亡抑制蛋白bcl-2的表达促进人滋养细胞凋亡,导致胎盘功能障碍,损害胎盘正常功能[4]。基质金属蛋白酶抑制因子2(TIMP-2)是对基质金属蛋白酶2(MMP-2)具有抑制作用的糖蛋白,研究表明,TIMP-2在子痫前期患者胎盘滋养细胞中表达升高,与MMP-2在滋养细胞浸润过程中相互影响,参与子痫前期发病[5]。目前miR-221和TIMP-2在EOSP合并FGR研究报道不多。本研究探讨miR-221和TIMP-2在EOSP患者血清与胎盘中表达及其相关性。
选择2018年9月-2020年10月在本院就诊的EOSP患者256例为观察对象,根据FGR分为非FGR组139例和FGR组117例。FGR诊断:出生体重低于同胎龄总体人群出生体重的10百分位或低于同胎龄正常体重的2个标准差。纳入标准:①符合EOSP诊断标准[6];②自然妊娠且单胎;③剖宫产终止妊娠。排除标准:①伴有原发性高血压、糖尿病、心血管疾病、甲状腺等疾病;②自身免疫性疾病;③临床资料不全。本研究样本采集均经过本院伦理委员会批准,患者签署知情同意书。
TIMP-2酶联免疫吸附测定试剂盒购自美国Elabscience公司,小鼠抗人TIMP-2单克隆抗体购自Abcam公司,miR-221及内参基因U6序列设计引物由上海生物工程公司合成。
血清样品:抽取孕妇产前空腹静脉血离心取血清,置-80℃保存备用。胎盘组织:胎盘娩出后,无菌剪取胎盘中央靠近脐带部位组织两块,其中一块生理盐水冲洗后置-80℃保存备用,另一块用4%多聚甲醛固定,用于免疫组化。
使用酶联免疫吸附法检测血清TIMP-2水平。
使用TRIzol试剂分别提取血清与胎盘组织中总RNA,使用反转录试剂盒反转录得到cDNA,置-20℃保存备用。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-221的表达。miR-221及内参基因U6的引物序列见表1。反应结束后,miR-221表达水平采用2-△△CT分析法计算。
表1 qRT-PCR引物序列
使用免疫组织化学SP法,将固定好的标本常规石蜡包埋,连续4 μm切片、二甲苯脱蜡,柠檬酸缓冲液抗原修复,再除内源性过氧化物酶活性,使用10%山羊血清封闭,加入鼠抗人TIMP-2单克隆抗体(1:1000),用已知阳性切片作为阳性对照,不加TIMP-2单克隆抗体的PBS缓冲液作为阴性对照,室温孵育2h,再加入二抗孵育30min,DAB显色,苏木素复染,酒精脱水封片。
光学显微镜下观察,TIMP-2主要定位于细胞膜或细胞质,随机抽取5个高倍视野,每个视野计算阳性细胞数:<5% 0分,6%~25% 1分,26%~50%2分,51%~75% 3分,>75% 4分;按照细胞染色强度评分:未着色0分,淡黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分。标本评估均由3名专业人员评定取平均值,将两项评分结果相乘,得分0~1分阴性(-),2~3分弱阳性(+),4~6分阳性(++),>6分强阳性(+++),≥2分统计为阳性。
非FGR组与FGR组年龄、发病孕周、终止妊娠孕周及初产妇比例均无差异(P>0.05)。见表1。
表1 两组一般资料比较
FGR组血清miR-221(1.65±0.23)、TIMP-2(38.52±8.36 ng/ml)高于非FGR组(1.03±0.21、25.34±6.78 ng/ml)(t=22.528、13.927,均P=0.000),胎盘组织miR-221(2.32±0.21)、TIMP-2蛋白阳性表达率(96例,82.1%)高于非FGR组(1.07±0.19)(74例,53.2%)(t=49.969,χ2=23.643,均P=0.000)。
血清miR-221、 TIMP-2水平均与新生儿体重呈负相关性(r=-0.541、-0.603,均P<0.05)。
预测EOSP患者发生FGR,血清miR-221曲线下面积为0.881,截断值为1.52,敏感度为78.6%,特异性为84.6%;血清TIMP-2曲线下面积为0.862,截断值为35.64ng/ml,敏感度为85.5%,特异度为79.5%;血清miR-221、TIMP-2联合预测EOSP患者发生FGR曲线下面积为0.921,敏感度为88.9%,特异度为84.2%。
子痫前期是一种严重的妊娠并发症,其中EOSP患者发病早且病情严重[7-8]。早期评估及治疗对改善不良妊娠结局有重要意义。
miRNA可调控多种生理病理过程,如细胞的增殖与凋亡、疾病以及肿瘤发生。研究表明miRNA异常表达与子痫前期、FGR等妊娠期并发症发生有关[9-10]。miR-221是人脐静脉内皮细胞中确定的特定miRNA,在子宫内膜蜕膜化过程中可参与间质细胞的分化,进而影响滋养细胞浸润能力[11]。秦薇等[12]研究表明,子痫前期孕妇胎盘中miR-221表达水平高于正常妊娠孕妇,与重度子痫前期的发病有关。Yang等[13]研究表明,miR-221-3p在子痫前期患者胎盘组织中表达下调,通过靶向血小板反应蛋白2(THBS2)促进滋养细胞生长、侵袭和迁移。本研究结果显示,EOSP合并FGR患者血清及胎盘组织中miR-221表达水平升高,提示水平升高可能与子痫前期患者FGR有关。
TIMPs能够特异性抑制基质金属蛋白酶(MMP)活性,TIMP-2对MMP-2 有较高的选择性抑制作用。正常状态下,TIMP-2和MMP-2相对平衡,维持细胞外基质成分的更新和自稳。若二者平衡被打破,会加速基质降解过程[14]。TIMP-2还可参与调控肿瘤细胞的迁移与侵袭,抑制TIMP-2的表达可抑制细胞的侵袭行为[15]。刘亚敏等[16]研究表明,妊娠滋养细胞疾病患者血清TIMP-2水平升高,参与妊娠滋养细胞疾病的发生及进展。本研究结果显示,与非FGR组比较, FGR组患者血清TIMP-2升高,提示TIMP-2与EOSP合并FGR有关,且胎盘组织中TIMP-2蛋白阳性表达率升高,提示TIMP-2表达水平升高可能与FGR胎盘功能障碍有关。
研究认为,子痫前期的发病与胎盘发育异常、血管内皮细胞功能损伤、免疫功能紊乱、遗传因素、炎症反应等有关。本研究发现,FGR组miR-221、TIMP-2水平升高,可能与滋养层细胞功能下降有关,TIMP-2蛋白表达增高,促使MMP-2表达相对减少导致滋养细胞浸润能力下降。研究表明[17],miR-221可通过靶向TIMP-2促进人脑胶质瘤细胞侵袭与血管生成,本研究推测miR-221、TIMP-2可能通过调控关系参与滋养细胞增殖与侵袭,导致胎儿生长受限。本文经相关分析显示,miR-221、TIMP-2 表达水平与新生儿体重均呈负相关性,进一步证实miR-221、TIMP-2水平升高与EOSP患者发生FGR有关。进一步分析,血清miR-221、TIMP-2联合预测EOSP发生FGR有一定临床价值,可能成为评估EOSP发生FGR的分子标志物。
综上,EOSP合并FGR患者血清和胎盘中miR-221、TIMP-2高表达,且与胎儿生长受限有关,有望成为评估EOSP发生FGR的分子标志物,但其具体作用机制仍需做进一步研究。