QuEChERS-dSPE-UPLC-MS/MS法筛查动物源性食品中9种兽药残留

◎ 周瑞铮，林秋凤，易华娟，张树权，陈锦杭，蔡润南

（东莞市食品药品检验所，广东 东莞 523808）

肉类和肉制品在人们饮食中扮演了重要的角色。预计未来10年，全球肉类产量和人均肉类摄入量将会持续增加，猪肉和鸡肉消费量将大幅上升，占全球肉类利用率的36%和35%，其次是牛肉（22%）和羊肉（4%）[1]。我国肉类及其制品消耗占比较大，兽药的滥用也逐渐发展为不能忽视的食品安全问题。通过对动物源食品不合格项目分析，发现畜禽肉中氯霉素、恩诺沙星等兽药违规使用问题较为突出[2]，水产制品中孔雀石绿滥用较多。动物源性产品兽药残留问题关乎公众健康，如氯霉素抑制人体骨髓造血机能，产生粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血等毒副作用[3-5]，沙星类药物会损害胃肠功能及中枢神经，影响儿童软骨生长发育[6-8]，β-受体激动剂影响人体血液循环，使中枢神经系统缺血和心肾功能损害[9-11]，孔雀石绿及其代谢物则具有致癌、致畸等毒副作用[12-14]。如今，兽药残留问题已成为全球的焦点，大多数国家和地区加强了对动物源性产品中兽药残留的监管，并制订了相关法规制度。我国在2019年发布的《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）规定喹诺酮类兽药最高残留限量（Maximum Residue Limit， MRL）为100 μg·kg-1，整顿办函〔2010〕50号、整顿办函〔2011〕1号、农业农村部公告第250号中规定不得使用克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、氯霉素、孔雀石绿。这些常见兽药残留项目检验方法有液相色谱法、液相色谱质谱联用法等[15-18]，现行的检验标准有GB/T 21312—2007、GB/T 19857—2005、GB/T22338—2008和GB/T 22286—2008，但这些标准前处理步骤相对复杂，检验效能较低，为降低检验成本，提高检验效率，设计一种高效、简洁、灵敏度高、可同一时间检验多种类别兽药的方法十分必要。QuEChERS方法具有操作简便、快速高效、成本低廉等特点[19-22]，结合超高效液相色谱-串联质谱法，能同时检测多种兽药残留，节省大量时间及实验成本，便于在食品检测机构进行样品初步筛查。本文建立了动物源食品中常见的4大类（恩诺沙星、环丙沙星、氟甲喹、孔雀石绿、隐色孔雀石绿、克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和氯霉素）共9种兽药残留的QuEChERS检测方法，满足实际工作的需要。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验材料：新鲜肉类（畜肉，禽肉，水产品）、加工肉制品（腌制品，酱卤肉），来自东莞市学校食堂及肉制品生产厂家。

试剂：甲醇、乙腈、正己烷（色谱纯，德国默克公司）；甲酸、乙酸铵（色谱纯，中国天津市科密欧化学试剂有限公司）；CNW dSPE兽药提取包、净化管(上海安谱实验科技股份有限公司)。

标准物质：氯霉素（中国计量科学研究院）；氯霉素-D5、恩诺沙星、氟甲喹、沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、莱克多巴胺（北京曼哈格生物科技有限公司）；环丙沙星、孔雀石绿草酸盐、隐色孔雀石绿（德国Dr.Ehrenstorfer公司）；孔雀石绿-D5、隐色孔雀石绿-D6、克伦特罗-D9（德国Witegar公司）；沙丁胺醇-D3（加拿大CDN公司）。

1.2 仪器与设备

LC30AD超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SCIEX 5500质谱联用仪(配ESI离子源，美国AB公司)；CPA225D电子分析天平（感量0.000 01 g，德国赛多利斯）；BSA223S电子分析天平（感量0.001 g，德国赛多利斯）；3K 15离心机（9 500 r·min-1，德国SIGMA）；超纯水机（Milli-Q Reference，德国默克）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的制备

分别精密称取适量氯霉素、孔雀石绿、隐色孔雀石绿，使用乙腈溶解并定容，恩诺沙星、环丙沙星、氟甲喹、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺使用甲醇溶解并定容，制成浓度为1.0 mg·mL-1的标准储备液，储于-20 ℃。临用时，用体积分数为50%乙腈水溶液稀释至孔雀石绿、氯霉素、β-受体激动剂质量浓度为10.0 ng·mL-1，喹诺酮质量浓度为200.0 ng·mL-1的混合标准工作液。

分别精密称取适量氯霉素-D5、孔雀石绿-D5、隐色孔雀石绿-D6使用乙腈溶解并定容，克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3使用甲醇溶解并定容，孔雀石绿-D5、隐色孔雀石绿-D6、克伦特罗-D9、沙丁胺醇-D3定容至100 μg·mL-1，氯霉素-D5定容至1.00 μg·mL-1，制成单一内标储备溶液。临用时，用50%乙腈水稀释至氯霉素-D5、孔雀石绿-D5及隐色孔雀石绿-D6质量浓度为100 ng·mL-1，β-受体激动剂类质量浓度为10.0 ng·mL-1的混合内标工作溶液。

1.3.2 样品溶液的制备

（1）提取。称取粉碎试样约2 g（精确到0.01 g）于50 mL聚丙烯离心管中，加入1袋兽药提取盐包，50 μL混合内标物工作溶液，加入15 mL 1%甲酸乙腈后剧烈振摇，使样品分散，涡旋5 min，超声10 min，8 000 r·min-1离心5 min，重复提取2次，合并两次提取液备用。

（2）净化。将提取液转移至兽药净化管，涡旋5 min，8 500 r·min-1离心5 min，转移上清液至100 mL棕色鸡心瓶，40 ℃水浴减压旋蒸至近干，加入1 mL 50%乙腈水复溶，过0.22 μm有机滤膜后，供液相-质谱测定。

1.3.3 色谱及质谱条件

（1）色谱条件。色谱柱：Boston， Green ODSAQ C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；流速：0.2 mL·min-1；进样体积：2.0 μL；柱温：35 ℃；流动相A：甲醇，流动相B：0.1%甲酸-1 mmol·L-1乙酸铵，洗脱梯度见表1。

表1 液相洗脱梯度表

（2）质谱条件。离子源：H-ESI；扫描模式：正负离子同时扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；雾化气（GS1）：379.2 kPa（氮气）；辅助气（GS2）：379.2 kPa（氮气）；气帘气（CUR）：206.8 kPa（氮气）；喷雾电压（IS）：5 500 V、-4 500 V；去溶剂温度（TEM）：350 ℃；碰撞气（CAD）：55.16 kPa（氮气）。离子对优化结果见表2。

表2 定性离子、定量离子、碰撞能量、去簇电压表

2 结果与分析

2.1 样品提取溶剂的优化

本文中涉及的兽药包含氟喹诺酮类、三苯甲烷类、β-受体激动剂类和氯霉素类，乙腈对上述几类兽药均有较好的提取效果，还可以有效去除蛋白，是较为理想的溶剂，但有研究表明氟喹诺酮类具有酸碱两性性质，在酸性或碱性条件下的提取效率更高，因此对乙腈、0.1%甲酸-乙腈，1%甲酸-乙腈进行比较[22]。3种提取溶剂的回收率结果如图1所示，综合考虑认为1%甲酸-乙腈对各组分的提取效果均较好，最终选择1%甲酸-乙腈作为提取溶剂。

图1 不同提取溶剂回收率对比图

2.2 流动相的优化

为了缩短检测时间，优化色谱峰形，本研究对常用的流动相体系进行了比较。文献报道显示[23-25]，动物源性食品兽药残留常用甲醇/水、乙腈/水体系作为流动相进行检测。本研究对这两个体系分别进行试验，比较在乙腈/水体系和甲醇/水体系对9种兽药、5种内标物化合物的分离效果、峰型的影响。乙腈-水体系大部分物质出峰时间集中在4～7 min，个别在9 min左右；甲醇-水体系则更加分散，3～9 min均有物质出峰，分离效果更好。但在不添加缓冲盐和调节pH的甲醇-水和乙腈-水体系下，部分组分的峰形较差，出现拖尾等情况。经试验，添加0.1%甲酸和1 mmol·L-1乙酸铵有利于提高分离度，对检测组分的峰形有明显改善。因此，选用甲醇、0.1%甲酸-1 mmol·L-1乙酸铵作为流动相。

2.3 线性关系、回收率、精密度

如表3所示，各组分在0.1～100 ng·mL-1浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.998。以定性离子的3倍信噪比(S/N=3)对应的检测限为检出限（Limit of Detection，LOD），测定各组分的检出限。本研究以检出限的1、5、10倍作为加标水平，对空白猪肉基质进行加标，每个水平分别进行6次平行试验，如表3所示，各组分的检出限在0.1～2.0 ng·mL-1，满足国家标准的检测需求。各组分的平均加标回收率为69.2%～115.4%，相对标准偏差为0.9%～12.7%，该方法回收率、精密度均符合《实验室质量控制规范 食品理化检验》（GB/T 27404—2008）附录F的检测方法确认的技术要求[16]。

表3 线性范围、线性方程、相关系数、检出限、回收率表

2.4 实际样品测定结果

运用本研究建立的方法与标准方法进行结果比对

（GB/T 21312—2007、GB/T 22286—2008、GB/T 19857—2005、GB/T 22338—2008），结果表明，大部分组分的QuEChERS方法与标准测定方法结果偏差在20%～30%，而莱克多巴胺的检测结果相对标准方法则相对较低，推测是因为样品处理时没有进行酶解，而莱克多巴胺与蛋白结合较为牢固。如果检验过程中对样品进行酶解，则需要较长的时间，效率低下不利于大批量筛查工作。现今检测仪器的灵敏度较高，即便只能提取部分莱克多巴胺，依然能满足日常筛查的需求，因此，本方法适合动物源性食品中兽药残留的初步筛查。

3 结论

本研究建立了QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法筛查动物源性食品中恩诺沙星、环丙沙星、氟甲喹、孔雀石绿、隐色孔雀石绿、克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、氯霉素共计9种兽药残留情况的分析方法，以1%甲酸乙腈作为溶剂，涡旋、超声进行提取，QuEChERS净化后旋蒸浓缩，50%乙腈-水复溶。各组分在0.1～100 ng·mL-1浓度范围内线性良好，相关系数R均大于0.998，平均加标回收率在69.2%～115.4%，相对平均偏差为0.9%～12.7%，重复性好。该方法可以实现高通量处理，大大提高工作效率，为食品安全日常监管提供了有效保障。