白芍水煎液对类风湿性关节炎患者的临床疗效

符译尹，蒲梅婷，潘田芬，陆志夫，于 乐

(1.三亚市人民医院，海南 三亚 572000；2.海口市中医医院，海南 海口 571103；3.九江市第一人民医院，江西 九江 332000)

类风湿性关节炎是以对称性多关节炎病变为主的全身性炎症性自身免疫疾病，多发于30～55岁[1-3]，其发病机制尚不明确，涉及到多个免疫系统的相关因子水平[4]，该病反复迁延性、对称性会合并多个小关节病变[5]，而且伴随滑膜炎、血管炎、软骨破坏[6]，早期症状为关节红、肿、热、痛及功能障碍，晚期关节严重畸形，影响患者生活水平和生存质量[7-8]。芍药干燥根中提取的糖苷类物质白芍总苷是其主要成分[9]，能通过多种途径抑制人体自身免疫反应，有抗菌、镇痛等作用，对类风湿性关节炎有疗效[10]。NF-κB信号通路在类风湿性关节炎发病机制中有2个作用：一是活化后调动促炎相关细胞因子表达，如IL-6等；二是促进IκBα磷酸化和p65向细胞核转运，从而加重炎症反应[11]。本研究探讨白芍水煎液对类风湿性关节炎患者的临床疗效对免疫调节功能的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料 2019年1月至2020年10月收治于三亚市人民医院的200例类风湿性关节炎患者，男性135例，女性65例，随机分为对照组及白芍水煎液高、中、低剂量组。其中，对照组男性33例，女性16例，病程(4.9±2.2)年；白芍水煎液高剂量组男性34例，女性17例，病程(4.8±2.3)年；白芍水煎液中剂量组男性34例，女性17例，病程(4.9±2.5)年；白芍水煎液低剂量组男性34例，女性15例，病程(4.8±1.9)年，4组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。研究经三亚市人民医院伦理委员会批准。

1.2 纳入标准 (1)符合ACR(自体细胞再生)联合EULAR(欧洲风湿病防治联合会)提出的类风湿性关节炎分类标准；(2)膝关节滑膜组织取自疗程结束需行膝关节置换术的类风湿性关节炎患者；(3)患者了解本研究，签署知情同意书。

1.3 排除标准 (1)合并感染；(2)合并肿瘤；(3)合并其他自身免疫性疾病。

1.4 材料 白芍(仁和大药房)。蛋白提取试剂盒(北京天坛生物制品股份有限公司)；p-p65抗体、p-IκBα抗体、IL-6抗体、IL-17A抗体、IL-10抗体、山羊抗兔二抗(辽宁成大生物股份有限公司)；DAB显色盒、NF-κB激活-核转运检测试剂盒、苏木精染色液(上海莱士血液制品股份有限公司)；共聚焦荧光显微镜、石蜡切片机(上海丰实试验仪器有限公司)。

1.5 治疗手段 将80 g白芍加到500 g清水中，水煎1.5 h后得到水煎液，低、中、高剂量组患者每天每次分别口服15、30、45 mg；对照组不给予任何药物。4组疗程均为12周。

1.6 疗效评价 参考文献[12]报道，(1)显效，晨僵、肿胀、关节疼痛等症状完全消失,体征、睡眠达到正常水平；(2)有效，晨僵、肿胀、关节疼痛等症状有所改善,体征、睡眠基本达到正常水平；(3)无效，晨僵、肿胀、关节疼痛等症状无显著改善甚至加剧，体征状况出现异常,睡眠严重受到影响，总有效率=[(有效例数+显效例数)/总例数]×100%。

1.7 指标检测

1.7.1 晨僵时间 检测患者从早晨感受关节僵硬到恢复正常所用的时间，即为晨僵时间。

1.7.2 症状评分 采用疼痛数字评分法(NRS)评价患者关节疼痛程度，总分10分，分值越高，疼痛越强烈。再采用容积法评价患者关节肿胀度。

1.7.3 实验室指标 包括血沉(ESR)、血清 C 反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)，患者于每天上午7：00采集空腹肱静脉血10 mL，离心取血清，采用XT-2000型SYSMEX 全自动血液分析仪、HITACHI 7060型全自动生化分析仪检测上述指标。

1.7.4 检测血清p-p65、p-IκBα、IL-6、IL-17A、IL-10水平检测 采用Western blotting法。按照蛋白提取试剂盒说明进行操作，提取患者血清中相关蛋白，测定其浓度，SDS-PAGE分离蛋白，PVDF转膜，脱脂牛奶封闭1.5 h，加入p-p65、p-IκBα、IL-6、IL-17A、IL-10抗体(1∶800)，在6 ℃下孵育过夜。TBST洗涤3次，每次10 min，加入HRP标记的二抗(1∶3 500)，在5 ℃下孵育1.5 h。TBST液洗涤3次，每次10 min，最后条带经Bio-RAD凝胶分析仪进行图像扫描分析灰度值测定，以p-p65、p-IκBα、IL-6、IL-17A、IL-10与GADPH灰度值的比值表示各蛋白相对表达量。

1.7.5 NF-κB p65核转运检测 采用免疫荧光染色法。取患者空腹肱静脉血，离心取血清，重悬于培养液中，以每孔210个的密度接种于6孔板中，待细胞铺底80%左右时吸除培养液，检测NF-κB p65转运，具体操作步骤按NF-κB激活-核转运检测试剂盒说明书进行，封片后，在共聚焦荧光显微镜下观察。

1.7.6 T细胞分化检测 采用免疫组织化学法。将患者膝关节滑膜组织制成标准石蜡切片，依次在二甲苯Ⅰ中浸泡5 min、二甲苯Ⅱ中浸泡5 min、乙醇中浸泡2 min、95%乙醇中浸泡3 min、85%乙醇中浸泡3 min、75%乙醇中浸泡3 min脱蜡，蒸馏水冲洗3 min，过氧化氢-甲醇溶液中浸泡10 min，PBS冲洗3次，滴加1∶800稀释一抗覆盖组织，在5 ℃下孵育过夜，次日PBS冲洗5 min(共3次)，二抗在40 ℃下孵育2 h，PBS冲洗5 min，滴加DAB显色液，自来水冲洗，苏木精染色2～3 min，1%盐酸酒精分化数秒，自来水返蓝20 min，记录显色情况，中性树胶封片，观察染色结果。

2 结果

2.1 临床疗效 白芍水煎液各剂量组总有效率高于对照组(P<0.05)，并呈剂量依赖性，见表1。

表1 4组临床疗效比较(n=50)Tab.1 Comparison of clinical efficacy among the four groups (n=50)

2.2 晨僵时间、症状评分 治疗后，白芍水煎液各剂量组晨僵时间短于对照组(P<0.05)，关节疼痛评分、关节肿胀度评分更低(P<0.05)，并呈剂量依赖性，见表2。

表2 4组晨僵时间、症状评分比较Tab.2 Comparison of morning stiffness time and symptom scores among the four groups n=50)

2.3 ESR、CRP、RF水平 治疗后，白芍水煎液各剂量组ESR、CRP、RF水平低于对照组(P<0.05)，并呈剂量依赖性，见表3。

表3 4组ESR、CRP、RF水平比较Tab.3 Comparison of ESR,CRP and RF levels among the four groups n=50)

2.4 血清p-p65、p-IκBα水平 患者给予白芍水煎液后，血清p-p65、p-IκBα水平明显受到抑制，并呈剂量依赖性，见图1。

图1 4组血清p-p65、p-IκBα水平Fig.1 Serum p-p65 and p-IκBα levels in four groups

2.5 NF-κB p65核转运 对照组NF-κB p65大多位于细胞核中，少数位于细胞质中；白芍水煎液各剂量组NF-κB p65水平在细胞核内逐渐减少，并呈剂量依赖性，见图2。

图2 4组NF-κB p65核转运Fig.2 NF-κB p65 nuclear transports in four groups

2.6 T细胞分化 白芍水煎液高剂量组Th17细胞数量少于对照组(P<0.05)，而Treg细胞数量增加(P<0.05)；患者给予白芍水煎液后，T细胞向Th17细胞的分化减少，T细胞向Treg细胞的分化增加，使原本失调的免疫调节功能得到一定恢复(P<0.05)，见图3。

注：A为对照组Th17细胞，B为白芍水煎液高剂量组Th17细胞，C为对照组Treg细胞，D为白芍水煎液高剂量组Treg细胞。图3 2组T细胞分化Fig.3 T cell differentiation in two groups

2.7 IL-6、IL-17A、IL-10水平 白芍水煎液各剂量组IL-6、IL-17A水平低于对照组(P<0.05)，IL-10水平更高(P<0.05)，见表4。相关性分析显示，IL-6水平与IL-17A水平呈正相关关系，而IL-6水平与IL-10水平呈负相关关系，见图4。

表4 4组IL-6、IL-17A、IL-10水平比较Tab.4 Comparison of IL-6,IL-17A and IL-10 levels among the four groups n=50)

注：A为Western blotting检测IL-6、IL-17A、IL-10水平，B、C分别为IL-6水平与IL-17A、IL-10水平的相关性分析。图4 4组IL-6、IL-17A、IL-10水平及相关性分析Fig.4 IL-6,IL-17A and IL-10 levels in four groups and correlation analysis

3 讨论

类风湿性关节炎是集骨纤维化、骨质破坏、软骨吸收、慢性炎性反应于一身的慢性自身免疫性疾病，主要病因是体内缺乏内源性糖皮质激素[13]，临床治疗大多采用非甾体消炎药、免疫抑制类药物，同时内源性肾上腺皮质激素也有抗炎效果[14]。NF-κB是类风湿性关节炎进展的炎性信号转导通道，可激活IκBα磷酸化，增加抗炎性p65活性及下游促炎因子IL-6表达，并联动其他炎症因子表达[15-16]。健康人体内的T细胞稳态平衡，而患上类风湿性关节炎后其稳态平衡打破，细胞过度的向促炎性的T细胞亚群分化。目前，大量学者从人体自身免疫调节出发，寻找治疗类风湿性关节炎的药物靶点[17-18]，并且分析白芍在治疗类风湿性关节炎方面有优势[19-20]。

本研究发现，白芍水煎液干预后类风湿性关节炎患者总有效率显著提升，临床不良症状显著减轻，并呈剂量依赖性；患者血清p-p65、p-IκBα表达受到抑制，并呈剂量依赖性，说明调节过程与NF-κB信号通路相关；膝关节滑膜组织中的促炎细胞Th17较对照组显著减少，抑炎细胞Treg显著增加，表明T细胞向Th17细胞的分化减少，向Treg细胞的分化增加，免疫调节功能增强；患者血清IL-6、IL-17A表达较对照组显著降低，IL-10表达显著升高；IL-6表达与IL-17A表达呈正相关，与IL-10表达呈负相关，表明白芍水煎液通过下调NF-κB信号通路来抑制Th17细胞分泌的促炎性细胞因子IL-17A，促进Treg分泌的抗炎性细胞因子IL-10，从而增强免疫调节功能。

综上所述，白芍水煎液可改善类风湿性关节炎患者临床症状，增强免疫调节功能，对病情进展有阻断作用，临床应用前景较好。但其他炎性细胞(如浆细胞等)在类风湿性关节炎中的作用尚不明确，需作进一步探索。