微RNA 转录后修饰相关研究进展

杨紫琳，赵雨娉，孙 武，陈 熹，姚玮艳

（1.上海交通大学医学院附属瑞金医院消化内科，上海 200025；2.天津医科大学附属肿瘤医院消化肿瘤科，天津 300060；3.南京大学生命科学学院，江苏 南京 210046）

微RNA(microRNA,miRNA)是真核生物体内一类长度约22 个核苷酸的内源性非编码单链小RNA，通过与靶信使RNA（messenger RNA，mRNA）3’端非编码区（3’-untranslated region，3’-UTR）结合而介导翻译水平的调控，参与调控细胞增殖、分化、凋亡等几乎所有生命活动[1]。目前认为miRNA 是未来疾病诊断、鉴别、预防、预后判断以及治疗的重要突破口[2-3]。部分基于miRNA 的治疗手段也已进入临床试验阶段，如miRNA122 拮抗剂米拉韦生（miravirsen）[4-5]、miRNA-34a 模拟 剂MRX34[6-7]等。

自然界中miRNA 存在不同类型的转录后修饰，这些修饰不仅提高了miRNA 多样性，还可调控miRNA 表达水平及生物学作用效果，促进其更精细、灵活、有效地发挥对基因表达的调节作用[8-10]。本文简要综述了目前miRNA 转录后修饰相关研究进展，并对这些修饰机制的应用前景进行评价及展望，旨在为miRNA 修饰的进一步研究提供理论依据和事实参考，更好地指导miRNA 的临床应用。

现有研究对于其转录后修饰的具体生物学效应仍不甚明了。目前研究较多的转录后修饰为miRNA 末端无需模板的核苷酸添加 （non-templated nucleotide additions,NTA），主要见于3’末端（3’NTA）。另外，miRNA 已知的核苷酸修饰类型有N6 甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）、3’末端2’-O-核糖甲基化修饰、N7-甲基鸟苷（N7-methylguanosine，m7G）[11]。

miRNA 的3’NTA

2005 年Li 等[10]证实植物中未被甲基化的miRNA 在3’末端可非模板化添加尿苷酸及腺苷酸，随后3’NTA 也陆续被发现存在于其他植物、哺乳动物、昆虫中[12-14]，其中也包括小干扰RNA （small interfering RNA,siRNA）[15]、PIWI 蛋白相互作用RNA（PIWI-interacting RNA,piRNA）[16]，这可能是自然界中miRNA 普遍存在的自身调节机制。3’NTA 可见于miRNA 成熟体及前体，4 种核苷酸（尿苷酸、腺苷酸、胞苷酸、鸟苷酸）均可对miRNA 进行非模板化的添加[17]，其中最常见类型为尿苷酸、腺苷酸。

一、miRNA 的3’末端尿苷化修饰

研究发现大多数生物体内miRNA 成熟体均存在3’末端尿苷化修饰引发的降解现象[10,12-14]。植物的尿苷酸转移酶hen1 阻抑基因（hen1 suppressor 1，HESO1）及哺乳动物的末端尿苷酸转移酶 （terminal uridylytransferase 4,TUT4）/TUT7均可介导miRNA 3’ 末端的尿苷化修饰，并由此引发修饰后miRNA 的降解[18-19]。尿苷化也可作用于miRNA 前体（precursor miRNA,pre-miRNA），阻断机体对前体结构的加工并影响miRNA 成熟——果蝇体内末端尿苷酸转移酶CG1091，主要介导pre-miRNA 的3’末端尿苷化，影响Dicer酶对pre-miRNA 的特异性识别以阻碍成熟miRNA 合成[20]；有趣的是，let-7 前体的单尿苷酸化可促进Dicer 酶的识别及对let-7 的加工过程，而在LIN28 存在下的寡尿苷酸化则阻止加工并诱导pre-miRNA 在干细胞和癌细胞中的降解，研究显示在发育过渡和肿瘤发生过程中，尿苷化功能的两面性可能有助于对let-7 表达的严格控制[21]，LIN28 介导let-7 的下调可能在发育、干细胞编程和肿瘤发生中起关键作用[21-22]。

尿苷化修饰还可以调节miRNA 的生物学活性。在对尿苷酸转移酶Zcchc11 的研究中，Jones 等[23]证实了Zcchc11 通过介导miRNA 尿苷化抑制胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）-1 相关miRNA 的沉默活性，增强IGF-1表达从而促进新生小鼠的生长与存活；类似的研究中，靶向作用于白介素6 mRNA 的miRNA26，可被TUT4 介导进行3’末端尿苷化修饰，但不影响自身稳定性，反而降低了对机体白介素6 mRNA 的作用效果[24]，但关于末端尿苷化影响miRNA 生物活性的机制尚未明确。

二、miRNA 的3’末端腺苷化修饰

与尿苷化修饰相反，末端腺苷化修饰往往可增加miRNA 稳定性。Lu 等[25]研究发现毛果杨中miRNA 3’末端大多存在腺苷化修饰，修饰后其结构更趋于稳定而不易被降解；谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GLD)-2 介导的3’ 末端单腺苷化能够选择性地稳定在人肝癌细胞株Huh7中明显高表达的miRNA122[26]。在一些特殊情况下3’末端的腺苷化修饰反而能够促进降解，Wispy 是果蝇中GLD-2 的同源蛋白，与GLD-2 介导腺苷化miRNA 122 的高稳定性不同，Wispy 促进母源miRNA 腺苷化却导致其丰度降低，起到清除母源miRNA 的作用[27]；类似的研究中，Boele 等[28]发现poly（A）聚合酶PAP 相关结构域（PAP associated domain containing，PAPD）5 介导人髓系白血病单核细胞THP-1 中miRNA21 的3’末端腺苷化并刺激其降解，研究还进一步证实机体存在一种末端核苷酸转移酶和核糖核酸外切酶的调控网络，可以靶向特定结构的成熟miRNA 以增强或防止其降解。

另外，近期研究发现某些miRNA 如miRNA2909 等的3’末端尿苷化修饰与腺苷化修饰可能还参与了外泌体的分选机制[29]，这也从另一方面提示了尿苷化/腺苷化修饰两者共同作为机体miRNA 的重要微调机制，对机体正常生命活动的维持起重要作用，其表达谱的改变或可作为疾病诊断及鉴别的标尺进一步研究。

miRNA 的m6A

在高等真核生物mRNA 和长链非编码RNA （long noncoding RNA，LncRNA）中，m6A 是最为普遍的内部修饰，指的是RNA 链中的腺苷酸（A）上第6 个氮（N）原子上发生的甲基化修饰，其形成动态可逆，在哺乳动物体内由甲基转移酶复合体[甲基化转移酶样蛋白（methyltransferase-like protein，METTL）3、METTL14、肾母细胞瘤1-关联蛋白（Wilms’ tumor 1-associating protein，WTAP）]、去甲基化酶[脂肪量和肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-associated protein，FTO）、α-酮戊二酸盐依赖性双加氧酶AlkB 同源蛋白5（α-ketoglutaratedependent dioxygenase AlkB homolog，ALKBH5）]及相应阅读器[YTH 结构域家族蛋白 （YTH domain family，YTHDF）、YTH 结构域包含蛋白（YTH domain containing，YTHDC）、核内不均一核糖核蛋白 （heterogeneous nuclear ribonucleo protein，HNRNP)A2B1、HNRNPC 等]协同调控[30]，广泛参与哺乳动物干细胞功能调控、肿瘤发生发展等多种生理病理过程[31-33]。

2015 年一项研究首次指出m6A 甲基化修饰同样也存在于初级miRNA（primary miRNA,pri-miRNA），证实m6A 甲基化修饰能够介导激活下游的微处理器迪乔治综合征危象区基因（DiGeorge syndrome critical region gene，DGCR）8，促进pri-miRNA 被DGCR8 特异性识别，启动并促进primiRNA 向pre-miRNA 和成熟体miRNA 的加工，该研究还提出METTL3 的异常表达很可能会引起肿瘤中部分miRNA的异常高表达[8]；m6A 修饰水平对于人体正常稳态具有重要作用，类似的研究中，Alarcón 等[34]发现在乳腺癌细胞中敲除m6A 结合蛋白HNRNPA2B1 可导致成熟miRNA 表达的减少和特定pri-miRNA 的核积累，其表型与METTL3 敲除结果相一致[8]。Berulava 等[35]在人胚胎肾293T 细胞（human embryo kidney 293T cell,HEK-293T） 中敲除介导m6A 去甲基化酶FTO 后，观察到249 个上调和35 个下调的miRNA（＞1.5 倍变化）。

miRNA 的m6A 修饰对于临床疾病的机制理解及治疗具有重要指导意义：在胰腺导管上皮细胞中，香烟烟雾促进pri-miRNA25 的m6A 修饰，增加成熟miRNA25-3p 的生成，而成熟miRNA 25-3p 可激活致癌性蛋白激酶B (protein kinase B,AKT)-p70S6K 信号转导，可促进胰腺癌发生发展，与胰腺癌患者的不良预后相关[36]；在肝癌细胞中，METTL14 作为甲基转移酶可以激活DGCR8，以m6A 依赖性方式增加成熟miRNA126 表达水平，而miRNA 126 参与抑制肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的转移，提示METTL14 可作为预防和治疗HCC 的靶标进行进一步研究[37]；此外，在黏菌素处理的小鼠肾小管上皮细胞（mice renal tubular epithelial cell,mRTEC）中过表达METTL3 后，发现可促进miRNA m6A 修饰以正调节miRNA873-5p 的成熟过程，通过Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1 （Kelch-like epichlorohydrin associated protein 1,Keap1）/核因子E2 相关因子2 (nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)途径抵抗黏菌素诱导的氧化应激和细胞凋亡，提出了m6A 修饰调控药物对于黏菌素肾毒性的治疗新见解[38]。

m6A 修饰是近年来发现的miRNA 生物合成过程中新的关键转录后修饰，其中参与m6A 修饰过程的各种小分子及蛋白的改变也可能影响miRNA 的生物合成及对基因的调控作用，进而影响疾病的发生、发展。然而到目前为止miRNA 的m6A 与疾病之间的相关研究仍较少，尚无m6A 是否也能够发生在miRNA 的报道，对于m6A 是否会影响miRNA 的稳定性以及是否参与miRNA 的选择性分泌这些问题尚无明确的解答。

miRNA 的3’末端2’-O-核糖甲基化修饰

2005 年，学术界首次在拟南芥中发现甲基转移酶hen1能够介导miRNA 3’末端2’-O-核糖甲基化修饰，即由甲基（-CH3）取代3’末端2’-O-核糖的一个自由羟基，使之提高自身稳定性并且增强了其对RNA 酶如核酸外切酶、连接酶、末端转移酶、聚合酶等的抵抗性，从而保证植物性状的稳定表达[9,39]。随后多项研究表明昆虫和哺乳动物体内多种小分子RNA 如siRNA、piRNA 等均具有3’末端2’-O-甲基化修饰[40-41]。线虫中miRNA 也存在3’末端2’-O-甲基化修饰现象，其体内HEN1 基因的敲除导致其miRNA 甲基化水平的降低，引起HEN1 突变体的生长发育停滞[42]。另外，自然界中p21、p19、辅助成分蛋白酶（helper component proteinase,HC-Pro）等病毒RNA 沉默因子感染植物时，可通过抑制hen 1 来降低miRNA 甲基化水平从而大大降低机体性状表达的稳定性[43]。迄今为止，学术界普遍认为哺乳动物体内的miRNA 不存在3’末端2’-O-甲基化修饰，目前在哺乳动物体内只发现与piRNA 以及神经元轴突内的piRNA 样非编码小RNA（piRNA-like small RNA,piLRNA）上存在着甲基转移酶hen1 同源蛋白（hen1 RNA methyltransferase，HENMT）1介导的3’末端2’-O-甲基化修饰[44-46]。

miRNA 的m7G

m7G 是转运RNA（transfer RNA，tRNA）、真核18S 核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）和mRNA 分子帽位置中较常见的修饰之一。既往由于缺乏灵敏的检测策略，m7G 在低丰度mRNA 和miRNA 中无法被检测到。2019 年一项研究首次证实miRNA 中存在m7G，研究证实在人肺癌细胞A549 中，由METTL1 介导特定pri-miRNA（如let-7e 等）的m7G 修饰通过直接影响pri-miRNA 的二级结构，以独特的方式促进miRNA 成熟体的加工。该部分m7G 修饰的pri-miRNA 具有共同功能——抑制细胞迁移，研究提出m7G 途径是miRNA功能的新型调节剂，可调节miRNA 的结构、生物发生、调节细胞迁移，直接靶向METTL1 的治疗思路可能作为未来一种有效且未经探索的策略，有待进一步探索[11]。

综上，miRNA 的转录后修饰对于调控miRNA 自身稳定性及生物学功能的发挥具有重要作用，可以使基因的沉默调控更为精准化，其普遍性、保守性、特异性表明这可能是一种全新维度的表观遗传学调控方式。尽管关于miRNA 在不同疾病中的作用机制及其转录后修饰的研究已取得一定进展，但两者之间的相互影响未见系统报道，深入理解两者之间的相关性有助于理解复杂的基因调控网络——在不同疾病的病理生理发展过程中，miRNA 除了表达水平发生改变外，其上游的加工修饰程度亦存在变化，是一种全新维度的表观遗传学调控方式，有助于揭示miRNA 发挥作用的分子机制及作用方式，又可引导人们深入研究不同疾病发生、发展的新机制，其中任何能够影响介导miRNA 修饰相关化合物的因素均可以影响miRNA 的生物合成及对基因的调控效果，这也将成为今后大多数miRNA 相关临床技术手段开发的一个重点方向。将两者应用到临床的早期诊断，在判断肿瘤的复发情况、预测肿瘤疗效和预后，以及开发特异性靶点药物等方面上具有很大的潜力。