铁死亡在哮喘气道炎症中的作用及针刺干预研究进展

汤蔚峰，滕方舟，宗雨婷，宋京蓉，秦静静，董竞成,2，魏颖,2

1. 复旦大学附属华山医院中西医结合科，上海200040；2. 复旦大学中西医结合研究院，上海200040

支气管哮喘（哮喘）是一种常见的慢性呼吸道疾病，是世界范围内严重影响人类健康的常见病、多发病之一。根据2015年全球疾病负担研究结果显示，全球哮喘患者高达3.58 亿[1]，成人哮喘患病率约为10%[2]，随着城市化、工业化等现代文明的发展，近年来哮喘平均患病率呈上升趋势，预计到2025年可达4 亿。儿童和青年人具有较高的哮喘发病率，是哮喘发病的主要人群，而老年人哮喘的发病率与青年人相似，且致死率更高，这可能与老年人存在基础疾病有关[3]。现代医学治疗哮喘能较好改善患者的哮喘症状，但在个体和人群中，哮喘治疗反应存在很大差异，部分患者的治疗反应较差[4]。传统医学对哮喘的认识是以中医理论为基础的，在治疗哮喘方面也积累了丰富的经验[5]，针灸在防治哮喘方面有很好的疗效[6]，其具有简便、安全有效、无不良反应的优势，在中医临床上有广泛的应用。铁死亡（ferroptosis）是新近发现的一种铁依赖的脂质过氧化驱动的非凋亡形式的调节性细胞死亡方式，其特征是脂质过氧化物铁依赖性地积累，引发质膜破坏，最终导致细胞死亡，其在形态、生物化学和遗传学上均不同于凋亡、坏死和自噬[7-10]。目前关于哮喘中铁死亡的研究较少，本课题组发现在尘螨诱导的哮喘模型中，肺组织中发生了铁死亡[11]；Wu 等[12]发现铁死亡诱导剂可以诱导嗜酸性粒细胞发生铁死亡，进而改善哮喘症状；而Bibi 等[13]用铁死亡诱导剂滴鼻，发现可以改善小鼠的哮喘症状。关于哮喘铁死亡的机制尚不清楚，但铁死亡的发现为哮喘发病机制研究提供了新的方向，也为针刺治疗哮喘的作用机制研究提供了新的思路。本文重点对气道炎症在哮喘中的作用、铁死亡的概念和调控、铁死亡在哮喘气道炎症中的作用以及针灸对哮喘炎症中细胞铁死亡的调控作用进行梳理和介绍，以期为哮喘发病机制的研究提供新的思路和方向。

1 气道炎症是哮喘病理改变的核心环节

哮喘是由多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症性疾病，临床表现为反复发作的喘息、气急，伴或不伴胸闷或咳嗽等症状，同时伴有气道高反应性（airway hyperresponsiveness，AHR）和可变的气流受限等气道功能障碍[14]。气道炎症是哮喘病理改变的核心环节，是哮喘病理过程的基本病理改变和反复发作的主要病理机制之一。气道的炎症反应是以气道上皮细胞为代表的结构细胞与T 淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞（eosinophils，EOS）、中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞等免疫细胞相互作用的结果，这些细胞分泌多种炎症介质和细胞因子，并相互作用，构成复杂的免疫调控网络，共同参与哮喘的气道炎症反应[15]。因此，控制哮喘气道炎症是治疗哮喘的关键。

气道上皮细胞在哮喘气道炎症中起主导作用。气道上皮细胞是呼吸道黏膜免疫系统的重要组成部分，是保护人体免于病原体侵犯的第一道屏障，在哮喘气道炎症的发生、发展过程中起着重要作用[16]。气道上皮细胞不仅具有屏障防御功能，还能在应激状态下分泌炎性介质并和炎性细胞、抗原递呈细胞相互作用，从而发挥免疫功能。气道上皮细胞可以分泌多种细胞因子激活免疫细胞和招募炎性细胞。其中，最重要的是胸腺基质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、白介素-25（interleukin25，IL-25）、IL-33、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage-colony stimulating factor，GM-CSF）和嗜酸性粒细胞趋化因子（Eotaxin）[17-20]。TSLP 和IL-25 可以激活树突状细胞，启动Th2 型细胞应答[17]。IL-33 能与巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和CD4+T 细胞等免疫细胞表面的ST2 受体结合，促进这些细胞释放大量的趋化因子和Th2 型细胞因子[18]。GM-CSF 可刺激造血干细胞向粒细胞和单核细胞分化，支持EOS 存活[19]。Eotaxin 可以将Th2 细胞、EOS、嗜碱性粒细胞和肥大细胞招募到炎性反应部位发挥效应，进一步恶化哮喘炎症[20]。

2 铁死亡及其在哮喘中的作用

2.1 铁死亡的概念和发生机制 铁死亡是新近发现的一种铁依赖的脂质过氧化驱动的非凋亡形式的调节性细胞死亡方式，其特征是脂质过氧化物铁依赖性地积累至致死水平，在形态、生物化学和遗传学上均不同于凋亡、坏死和自噬[7-10]。铁死亡在电镜下主要表现为线粒体外膜破坏、线粒体脊消失和膜密度增高，没有细胞凋亡时出现的染色体浓缩、细胞坏死时出现的细胞器肿胀以及细胞自噬时出现的双层膜囊泡形成[7-10]。2012年Dixon 等[21]在Cell 发表文章，正式将这种细胞死亡方式定义为“铁死亡”。铁死亡的最终执行者是脂质过氧化物，当过量的脂质过氧化物累积会引起质膜损伤，最终导致细胞铁死亡[22]。因此，脂质过氧化/抗氧化失衡是细胞发生铁死亡的关键。

2.2 ACSL4-LPCAT3-15LO 通路促进脂质过氧化和细胞铁死亡 酰基辅酶A 合成酶长链家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4）-溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（lysophosphatidylcholineacyltransferase3，LPCAT3）-15酯氧合酶（15-Lipoxygenases，15-LO）通路（ACSL4-LPCAT3-15LO 通路）是介导脂质过氧化和正向调控铁死亡的重要通路，其表达上调会促进细胞内磷脂过氧化物的积累，导致细胞铁死亡[23]。ACSL4 是铁死亡通路上的一个关键基因，参与细胞膜中游离多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）-磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）的生物合成和重塑，促进铁死亡的发生[24-25]。敲除胚胎成纤维细胞中的ACSL4，细胞对铁死亡抗性增加[25]，敲除胶质瘤细胞中的ACSL4，胶质瘤细胞铁死亡被抑制[24]。LPCAT3 是脂质合成途径中的重要一环，其高表达会上调质膜中不饱和脂肪酸含量，提高细胞对铁死亡的敏感性，敲低LPCAT3 表达能够降低细胞对铁死亡的敏感性[26]。15-LO是催化不饱和脂肪酸代谢的关键酶之一，其主要有15-LO1和15-LO2 2 种亚型，目前15-LO1 被证实在肺组织中有表达分布更广泛[27]。在脂质合成过程中，上游限速酶ACSL4将乙酰辅酶A（coenzyme A，CoA）与花生四烯酸（arachidonic acid，AA）结合，形成长链多不饱和脂酰CoA（AA-CoA）。随后在LPCAT3 作用下，AA-CoA 与PE 反应，形成PEAA，进入脂质氧化途径。PE-AA 在15-LO 作用下，形成磷脂过氧化物。磷脂过氧化物的积累一方面会导致细胞内辅酶Q10 (Coenzyme Q10，CoQ10) 和谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭，另一方面会提高细胞对铁死亡的敏感性。以上研究提示ACSL4-15LO 是形成磷脂过氧化物、促进脂质过氧化和正向调控铁死亡的重要通路。见图1。

2.3 SLC7A11-GSH-GPX4 通路抑制脂质过氧化和细胞铁死亡 胱氨酸/谷氨酸逆转运系统轻链亚基SLC7A11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）-GSH-谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）通路（SLC7A11-GSH-GPX4）通路，介导了抗氧化反应，具有拮抗脂质过氧化和抑制铁死亡的关键作用[28-31]。胱氨酸/谷氨酸逆转运系统（cystine/glutamate transporter, System Xc-）、GSH 和GPX4 在脂质过氧化过程中起抗氧化作用。System Xc-从细胞外摄取胱氨酸，并将细胞内的谷氨酸转运至胞外，摄入细胞内的胱氨酸被还原为半胱氨酸，参与GSH 合成和下游脂质过氧化过程，System Xc-的活性与催化亚基SLC7A11的表达呈正相关[28]。抑制System Xc-导致的氨基酸代谢失衡会引发铁死亡[28，32]。在胰腺导管腺癌中，抑制System Xc-减少胱氨酸摄取能够诱导细胞发生铁死亡[33]。System Xc-在铁死亡中起着非常重要的作用，而SLC7A11 是调控“铁超载介导铁死亡”的关键蛋白之一。GSH 作为GPX4 的底物参与细胞内的抗氧化系统，是影响铁死亡发生的关键因素[29]。GSH 缺失可导致GPX4 失活和细胞内脂质过氧化物增加，诱导肝癌细胞铁死亡[30]。GPX4 是一类含有硒代半胱氨酸的还原酶，通过消耗GSH 将脂肪酸、磷脂和胆固醇等复合脂质中的过氧化物还原为稳定的羟基脂质，从而抑制细胞膜的链式氧化[31]。GPX4 占据了铁死亡的核心位置，是清除过氧化脂质的重要途径，其表达水平对细胞内氧化脂质的还原具有重要影响。在细胞中胱氨酸/半胱氨酸供应充足的情况下，抑制GPX4 能够引起PUFA 氧化和脂肪酸自由基产生，导致铁死亡[34]。在细胞中过表达GPX4 能增加铁死亡抗性，敲低GPX4 能够促进铁死亡[35]。香烟烟雾诱导的慢性阻塞性肺疾病小鼠发生铁死亡，GPX4+/小鼠表现出更明显的脂质过氧化水平和气道上皮细胞铁死亡[36]。可见，SLC7A11-GSH-GPX4 通路具有拮抗脂质过氧化和抑制铁死亡的作用。综上所述，ACSL4-LPCAT3-15LO 与SLC7A11-GSH-GPX4 通路，分别介导了脂质的过氧化与抗氧化反应，两者的相互制约维持着脂质氧化的平衡，并共同参与对铁死亡的调控过程（图1）。

2.4 气道上皮细胞铁死亡促进哮喘炎症反应 15-LO 通常以游离PUFA 为底物，催化磷脂过氧化物产生，在IL-4/IL-13驱动的Ⅱ型炎症反应中，15-LO 能与磷脂酰乙醇胺结合蛋白1（phosphatidylethanolamine-binding protein 1，PEBP1）结合，促进哮喘患者气道上皮细胞发生铁死亡[27]。稳定期和重症哮喘患者的气道上皮细胞中，均可以检测到15-LO表达上调，且其表达水平与哮喘的严重程度呈正相关[37]。另有研究发现，15-LO1 能够调控IL-13 诱导的人气道上皮细胞粘蛋白表达[38]，促进炎症反应。GPX4 能够分解15-LO催化游离PUFA 产生的氧化PE，减少磷脂过氧化物堆积，抑制铁死亡发生[27]。最新的研究发现，IL-6 通过诱导活性氧依赖的脂质过氧化促进支气管上皮细胞铁死亡[39]。以上研究提示，气道上皮细胞的铁死亡参与哮喘的炎症反应，其在哮喘病理进展中发挥重要作用。

3 针刺对哮喘炎症中细胞铁死亡的调控

哮喘属于中医的哮病范畴，祖国医学早在内经中就有“喘鸣”的记载，如《素问. 阴阳别论篇》中提到“起则熏肺，使人喘鸣”。明代张景岳《景岳全书. 喘促》说“喘有夙根，遇寒即发、或遇劳即发者，亦名哮喘”。哮病反复发作，难以治愈，乃是由于“内有壅塞之气，外有非时之感，膈有胶固之痰，三者相合，闭拒气道，搏击有声，发为哮病”。临床和系列实验研究证实了针刺治疗哮喘的有效性[40-43]。临床研究结果表明，针刺治疗对于提高哮喘的控制水平，改善患者生活质量具有重要作用。系列实验研究结果显示针灸治疗哮喘的作用主要体现在调节免疫和抑制炎症方面。铁死亡在哮喘炎症中的作用以及针刺对哮喘铁死亡的调控作用的相关研究尚处于起步阶段。本课题组运用蛋白组学技术研究了针刺治疗哮喘的相关作用机理[44]，结果显示，哮喘的病理过程与铁死亡密切相关，针刺治疗哮喘能够调控铁死亡的相关环节，有效延缓哮喘气道炎症和病情进展。研究发现，卵清蛋白（ovalbumin，OVA）诱导的小鼠哮喘模型中，除了典型的气道炎症相关变化外，还发生了铁死亡相关改变，表现为丙二醛（malonaldehyde,MDA）明显升高，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和GSH 明显降低。给予针刺治疗后，气道炎症明显缓解，MDA 表达明显下调，SOD 和GSH 明显上调。此外，针刺治疗哮喘还能够调控铁死亡通路中SLC3A2 和谷氨酸-半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligase, GCL) 表达，因此认为针刺治疗哮喘的效应与调控铁死亡相关。但是，针刺治疗哮喘究竟如何调控铁死亡，还需要进一步深入的研究。

4 展望

哮喘是由多种细胞及细胞组分参与的慢性气道炎症性疾病，针灸治疗哮喘具有良好的疗效，但是针灸抗哮喘效应的具体作用机理尚未完全阐明，限制了针刺疗法在哮喘临床治疗中的广泛应用。铁死亡是新发现的一种程序性细胞死亡方式，其在哮喘发病机制中的作用日益受到关注。同时，针刺通过调控铁死亡信号发挥抗哮喘作用也被初步证实，这为阐明针刺治疗哮喘的疗效机理提供了新的思路。然而，目前相关研究仍处于起步阶段，针刺调控哮喘发病过程中出现的铁死亡事件具体涉及哪些细胞，以及与哮喘病理变化存在何种关系，仍是需要深入研究的方向。另外，针刺调控了哪些细胞的铁死亡而发挥抗哮喘疗效，也是值得关注的重点。

注：Glutamate：谷氨酸；Cystine：胱氨酸；Cysteine：半胱氨酸；ACSL4：酰基辅酶A 合成酶长链家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4）；LPCAT3：溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3）；15-LO1： 15 酯氧合酶1（15-Lipoxygenases-1）；GSH：谷胱甘肽（glutathione）; GPX4：谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4）；Lipid Peroxides：脂质过氧化；Ferroptosis：铁死亡；CoA：乙酰辅酶A（coenzyme A）；AA：花生四烯酸（arachidonic acid）；PE：磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine）