大豆抗病性和分子标记及分子辅助育种研究进展＊

韩英鹏，杨振红

（东北农业大学大豆研究所/大豆生物学教育部重点实验室/农业农村部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150030）

1 大豆分子标记及分子辅助育种研究的重要性

大豆是我国最重要的粮食和油料作物之一，近年来，我国大豆的需求量逐步增加，仅2019年，需求总量就高达10 500万t，但国产大豆产量仅为1 809万t，需求缺口高达8 700万t左右，并有不断扩大的趋势。面对进口大豆依赖度越来越高的窘况，合理运用多种育种手段培育优质、高产、多抗大豆新品种，来提高大豆产量和品质，填补产需缺口是大豆育种家们的首要任务[1]。

相较传统育种手段，分子标记辅助育种具有育种年限短、效率高、准确性强等特点，成为大豆育种研究的热点[2]。近年来基因组技术的发展和DNA标记逐步整合到大豆遗传连锁图谱中，目前已鉴定出大量与重要性状相关的QTL，其部分QTL已应用于大豆分子辅助标记育种[3]。王传之等[4]利用抗病标记对自然群体材料进行基因型鉴定，筛选出符合预期的抗花叶病毒病SC7株系的大豆新品系；叶俊华等[5]利用大豆抗胞囊线虫病基因和耐盐基因的5个KASP标记及大豆抗花叶病毒的1个SCAP标记，对1 489份大豆品种的基因型进行了鉴定，筛选出多个抗病耐盐新种质。李琼等[6]以周豆25号和周豆18号杂交后自交获得F2群体为材料，运用BSA方法从144对大豆高蛋白基因SSR分子标记中，鉴定出贡献率高的satt182并验证了其在分子辅助选育高蛋白品系中的作用。充分了解与大豆重要性状相关的QTL及其分子标记，及时掌握大豆分子辅助育种方面的最新动态，对加快大豆育种进程及提高育种准确性十分有利。综述汇总了2021年分子标记及抗病育种的主要进展，对大豆分子标记和抗病育种前景进行展望，期望总结前人的研究成果，为大豆分子辅助育种提供有力工具。

2 国际相关研究动态

对2021年国内外大豆分子标记及分子辅助育种方面的研究报告进行查阅汇总，发现主要集中于抗病、抗逆、产量和品质性状上，这些研究大多通过连锁分析、关联分析及BSA等策略之间的结合，获得与重要农艺性状相关的QTL和SNP标记。通过对挖掘的遗传位点精细定位，将鉴定出与性状相关的候选基因应用于分子辅助育种中，为验证基因功能，梳理表达机制提供便利。通过开发与其连锁的分子标记再利用，能够改进遗传图谱的精度，定位新的性状相关候选基因。

2.1 国际大豆抗病性状研究

大豆疫霉根腐病方面，Li等[7]通过酵母双杂交和双分子荧光互补（BIFC）实验，证明大豆疫霉效应因子Avr1b与E3泛素连接酶GmPUB1的相互作用是被携带抗性-b和-k基因大豆识别的前提。大豆菌核病方面，草酸（OA）是核盘菌导致大豆菌核病发生的重要毒力因子，McCaghey等[8]以草酰乙酸乙酰水解酶（Ssoah1）缺失突变体是OA缺陷型且对大豆无致病性为切入点，将靶向Ssoah1的BPMV载体（pBPMV-OA）接种大豆。结果显示，与空载体对照植物相比，pBPMV-OA接种的植物对核盘菌的抗性增强。大豆胞囊线虫方面，Kofsky等[9]从野生大豆资源种鉴定出SCN抗性生态型NRS100，同时解析了该生态型通过抑制茉莉酸信号通路，允许水杨酸（SA）信号激活SCN抗性反应，并通过多胺的合成过程促进根细胞壁结构的完整性。Ravelombola等[10]通过全基因组关联研究（GWAS）和基因组选择（GS）结合的方法，验证了大豆耐受指数（TI）对SCN感染的大豆基因型之间存在差异；SMR、GLM（PCA）和MLM（PCA+K）模型分别鉴定到35，21和6个SNP与SCN耐受性相关，其中6个SNP在模型之间重叠，适合精细定位抗SCN候选基因。

2.2 国际大豆抗逆性状研究

大豆耐涝方面，Sharmin等[11]利用243个品种中获得的34718个SNP进行GWAS分析，通过混合线性模型（MLM）和多位点随机SNP效应混合线性模型（mrMLM），分别定位到2个与种子淹水耐受性相关的SNP位点。耐旱方面，Chuong等[12]利用转基因技术，将大豆GmHP08基因导入拟南芥异源表达。在缺水条件下，与野生型（WT）比较，转GmHP08基因拟南芥存活率更高，抗氧化酶编码基因的表达明显增强。相反，衰老相关基因之一的GmSAG13基因和几种脱落酸（ABA）相关基因的表达受到抑制。Chamarthi等[13]以6个环境条件下种植的200份不同成熟度组（MG）IV材料和6个检验品种为材料，利用34 680个单核苷酸多态性（SNPs）进行关联作图，识别出188个与冠层萎蔫（CW）相关的显著SNP，其附近共鉴定出183个候选基因，其中57个SNP存在于直接或间接地与蒸腾或节水有关的基因中。

2.3 国际大豆产量性状研究

大豆豆荚种子数方面，Jeong等[14]以Sowon（窄小叶和高豆荚粒数）和V94-5152（宽小叶和低豆荚粒数）的杂交后代BC3F2种群为研究材料，通过高分辨率作图法划定到一个66 kb控制窄叶形状和NSPP（每荚豆荚粒数）性状的基因组区域，该区域包含3个与豆荚粒数相关的候选基因。百粒重方面，Ravelombola等[15]通过全基因组关联分析（GWAS）和基因组选择（GS）方法评估了250个种质和10 259个高质量SNP，鉴定出37个与种子重量相关的SNP，23个与大豆产量相关的SNP。KIX结构域蛋白家族成员在植物中负调控细胞增殖，Nguyen等[16]利用正向遗传方法和CRISPR/Cas9基因编辑技术使大豆中GmKIX8-1基因不表达，结果发现功能缺失的GmKIX8-1突变体显著增加了大豆种子的气生器官。

2.4 国际大豆品质性状研究

大豆异黄酮含量方面，Knizia等[17]以SNP位点绘制了Williams 82重组自交系（RIL）群体的遗传连锁图谱，NC-2018和IL-2020 2个环境条件下在染色体（Chrs.）2、4、5、6、10、12、15、19 和 20上，共鉴定了27个控制种子异黄酮性状的QTL，其中Chrs.2、4、5、12、15和19上的6个QTL为新位点，剩余21个QTL已通过GWAS方法得到鉴定。风味方面，大豆籽粒中的脂氧合酶（Lox1，Lox2和Lox3）会使大豆制品产生豆腥味，影响大豆在食品加工中的利用。Carpentieri等[18]利用编码Lox1，Lox2和Lox3三种酶的遗传标记分析发现，品种BRS213中存在纯合的空等位基因Lx3，与BR36杂交地F2分离群体中鉴定出杂合子杂合和纯合Lx3系。另外，通过遗传标记Satt090和Satt417确认出亲本品种BRS 213中存在纯合子Lx2空等位基因。此外，Kumar等[19]利用改良标记辅助回交技术，培育出遗传上不含脂氧合酶-2的基因型NRC132，以期提高大豆在制造食品中的利用率。

3 国内相关研究动态

3.1 国内大豆抗病性状研究

大豆疫霉根腐病方面，Lin等[20]以易感E13390与抗性E13901杂交获得的228个F4∶5家系为遗传定位群体，采用ICIM作图法定位了qPsan5.1和qP-san16.1 2个QTL位点，2个位点之间产生加性互作作用，应对MPS17-22疫霉菌株的感染。过氧化物酶相关基因GmSPOD编码蛋白能够使细胞加快积累活性氧（ROS），破坏细胞膜结构，影响作物的生长，bHLH转录因子GmPIB1可以抑制GmSPOD的表达，提高毛状根对大豆疫霉根腐病的抗性，Liu等[21]利用Co-IP和MS对过表达GmPIB1的转基因大豆分析，鉴定出392个可能与GmPIB1互作的蛋白，利用荧光素酶互补和酵母双杂交方法发现只有26S蛋白酶体调节亚基GmSPOD与GmPIB1相互作用；过表达GmSPOD-OE毛状根中26S蛋白酶体活性显著高于对照，对大豆疫霉菌的抗性显著提高；GmSPOD-RNAi毛状根中26S蛋白酶体活性显著低于对照，对大豆疫霉菌的敏感性增强，上述结果解释了大豆26S蛋白酶体调控病原菌反应的重要机制。花叶病毒方面，Yuan等[22]利用祁黄-1×南农1138-2杂交组合中近等基因系R（RSC3Q）和S（RSC3Q）接种SMV后，发现感染早期SC3介导的抗性中茉莉酸抑制基因（TIFY/JAZ）和脱落酸诱导基因（PP2C3a）在R系上调，表明茉莉酸和脱落酸激素在大豆抗SMV的响应中扮演着角色。相较Yuan[22]等的通路研究，Liu等[23]以表型定位基因的方法，将抗BCMV和SMV的大豆变异品种V94-5152与敏感品种Williams 82杂交的F2接种BCMV分离株HZZB011，定位到一个位于BARCSOYSSR_02_0617下游0.2 cM处的抗BCMV-HZZB011的分子标记，其附近分布有10个候选基因。大豆孢囊线虫方面，Zhou等[24]从地方品种PI567516C中鉴定的QTL位点qSCN10被证实对多种SCN有抗性，精细定位到的区域内含有51个候选基因，其中4个与防御相关的基因受SCN侵染的调节。对该位点进行进一步分析时，发现其结构，进化关系以及变异程度均有别于已报道的QTL，田间试验中，该位点同样表现出较好的性状，确定PI567516C作为新颖遗传抗性大豆资源的可能性。Shi等[25]通过SNP标记及SCN抗性的GWAS分析，在菜豆pv01、03、06、07、09、10和11上同样检测到12个与生理小种HG型抗性相关的SNPs。还有Jiang等[26]的研究表明，在大豆孢囊虫胁迫下，东农L-10（SCN 4抗性品种）和黑农37（SCN 4易感品种）之间差异表达基因数量不同，东农L-10中PR蛋白家族基因GmRSCN4-1（Glyma.05G204800）和细胞色素P450家族基因GmRSCN4-2（Glyma.16G195600）的相对表达水平显着高于黑农37。

3.2 国内大豆抗逆性状研究

大豆耐旱方面，Chen等[27]通过酵母双杂交、免疫共沉淀和双分子荧光互补技术，发现在干旱胁迫下细胞核中的GmNTF2B-1能够与氧化还原酶GmOXR17相互作用，促进后者从细胞质转移至细胞核，增强核内活性氧（ROS）的清除，进而提高大豆抗旱性。耐盐方面，Xun等[28]通过构建GmADR1基因启动子的过表达载体，研究发现被转化大豆植株的耐盐基因GmCaM4的表达得到增强；与未转化的野生型相比，转基因植物具有显著的耐盐性。表明通过转基因手段引入内源启动子可以驱动大豆特定组织和器官中功能基因的表达。Gm-CIPK是盐过度敏感（SOS2-like）蛋白，Ketehouli等[29]研究表明在盐水、干旱或脱落酸（ABA）胁迫GmPKS4表达上调，GmPKS4的过表达增强了转基因拟南芥和大豆毛根体内活性氧的清除、渗透物的合成和应激相关基因的转录调控。耐铝方面，Wang等[30]首先通过GO和KEGG富集分析，发现未处理组和铝处理组之间的729个差异表达基因（DEG）主要富集于防御反应、质膜和分子转导活性途径。通过加权基因共表达网络分析维恩图筛选出的815个DEG，鉴定出未处理组和铝处理组之间差异最大的5个DEG。

3.3 国内大豆产量性状研究

大豆荚数方面，Ln是拟南芥JAGGED（JAG）在大豆中的同源基因GmJAGGED1，属于锌指蛋白家族，对Ln的近等基因系表型研究发现，NIL-Ln的豆荚一般为3粒荚和2粒荚，NIL-ln系中通常具有较多的4粒荚和3粒荚，说明Ln是荚粒数的相关基因[31]。杜浩等[32]为了将Ln基因应用于低纬度地区大豆育种中，通过开发Ln基因的分子标记，连续回交后将Ln基因代换到圆叶型品种Williams 82和华夏3中，获得了4粒荚较多的大豆新材料。裂荚方面，豆荚开裂性状在大豆成熟后期对大豆产量影响较大，有效控制豆荚的开裂，可以防止自然环境和机械因素所造成的减产。Han等[33]首先对黑河43（抗裂型）和黑河18（抗裂型）2个品种子代的落粒率进行遗传分析，鉴定出黑河43的抗裂性遗传力高，进一步利用黑河43×黑河18的RIS群体构建的分离群体进行定位分析，发现包含19个基因的qPD05-1位点，此研究为大豆抗裂基因的筛选鉴定提供了可靠的标记。百粒重方面，Zhang等[34]在4环境下133个中国大豆品种的百粒重（100-SW）表型数据，并利用82187个SNPs进行GWAS分析，至少两坏境中重复检测到27个SNP，其中有7个是百粒重（100-SW）的大效应标记，通过对标记附近的潜在基因进行qRT-PCR，发现有3个候选基因与百粒重相关性紧密。Zhang等[35]对国内283个大豆种质中获得的大量高质量SNP及进行GWAS分析，确定了5个与种子重量相关的基因座，其中qHSW-16区域中Soy-ZH13_16G122400鉴定为控制种子重量的新型候选基因。远月丽[36]对氮高效大豆坡黄、低氮敏感大豆84-70以及杂交后的RILs群体225个子代进行HiSeq测序，构建了高密度遗传图谱，结合115个家系4个氮效率相关表型性状进行QTL定位分析。检测到16个主效QTLs，均位于11号染色体。qTDW-20位点在正常氮条件和低氮胁迫下同时被检测到，对定位到的主效QTLs所在区间进行基因功能注释，预测到16个与转录调节、信号传导、氨基酸合成和能量转换等性状相关的候选基因。

3.4 国内大豆品质性状研究

大豆豆荚颜色方面，Chang等[37]将187份材料组成的大豆关联组（SAP）与284份RIL材料结合进行全基因组关联分析，鉴定出豆荚颜色相关位点qPC3和qPC19，分别位于第3和第19染色体，12个荚果大小相关的稳定QTL。在种皮形态方面，Liu等[38]以改良野生大豆染色体片段代换系（SojaCSSLP5）群体为研究材料，利用基因重测序，得到1 366个SNPLDB（SNP连锁-不平衡块）的物理图谱，利用SNPLDB-map，鉴定出2个与种皮颜色连锁相关的基因座，6个与开花期相关的基因座。此外结合亲本RNA-seq和DNA-重测序，对2个SCC和6个DTF候选基因[包括3个已克隆的（G、E2和GmPRR3B）和5个新检测的]进行了核苷酸突变水平的预测和验证，发现8个亲本等位基因中有6个与303份种质材料相同的等位基因，表明野生品种与栽培品种组合形成的染色体片段代换系可以作为鉴定野生和栽培候选基因等位基因的有效平台。营养成分方面，主要体现上油分、蛋白和异黄酮含量等物质成分。选取含油量存在差异的大豆品种：合农75（23.40%）、高油大豆品种合丰50（22.57%）以及低油分含量大豆品种抗线虫4号，采用毛细管电泳技术对合农25个油分相关SSR分子标记进行分析，结果显示，有21个SSR由母本合丰50遗传，10个SSR来源于父本抗线虫4号，油份超亲累加性状的分子标记4个[39]。Sung等[40]利用GC仪测定多环境下621份品种的FAs谱，参照已公开的SoySNP50K基因型数据进行GWAS关联分析，确定了43个与脂肪酸显著相关的基因组区域，其中包括9种新的环境特异性FA相关基因组区域。Zhang等[41]同样利用SoySNP50K基因型数据对211份大豆材料的油分、蛋白质以及水溶性蛋白性状进行GWAS关联分析，分别鉴定出3个蛋白质、4个油脂、5个水溶性蛋白质含量相关的QTL，多环境下5个QTL被检测到，进一步分析发现，各QTL位点处的基因与3种性状的关系为负相关。这表明通过分子标记所筛选的候选基因，既可表现为促进作用，也能起抑制作用。Li等[42]首先根据（垦丰14×垦丰15）×（河农48×垦丰19）的重组自交系获得2 232个SNP构建了分子遗传图谱，整理10个环境条件下蛋白质和油分表型数据，采用ICIM法进行QTL分析，最终筛选出6个QTN衰减区基因，其中有4个候选基因与大豆蛋白的合成代谢相关。而刘家伶等[43]为了构建脂肪和蛋白含量性状上存在显著差异的大豆高密度遗传图，首先利用吉农45和绥农76杂交的F2代分离群体获得SNP标记进行构建，然后结合群体籽粒脂肪和蛋白含量表型数据进行关联分析和基因注释，最后筛选到222个与脂肪和蛋白贮藏、油脂生物合成、油分代谢过程、脂肪酸生物合成、种子发育和种子萌发相关的基因。杨红燕等[44]利用川渝地区主要的232份品种材料在2个环境中的表型数据进行整理，然后结合大豆20条染色体上的SSR标记通过混合线性模型进行GWAS分析，最后筛选出与蛋白质含量显著关联的位点有16个，贡献率与油脂含量相关的位点有19个，贡献率最高分别为4.02%、4.67%。在异黄酮含量方面，Yang等[45]对来自各国250个地方品种和栽培品种进行重测序，筛选鉴定出3个与异黄酮含量相关的候选基因。

4 发展与建议

大豆是我国主粮作物之一，对稳定粮食安全起着重要作用。由于国内大豆产量低，品质差，自2004年，我国开始从国外进口大豆，截至2021年，进口总量约占国内大豆总需的85%。如何有效且快速地选育出产量高、品质优及抗性强的大豆品种成为难题。随着信息化的发展，分子生物技术得到广泛应用，以指导性强、操作简单、育种年限短等特点成为首选工具，并随着各种辅助型技术的开发和利用，在分子范畴上，大豆的遗传机理被普遍研究。分子标记和分子辅助育种手段的应用使大量的大豆抗性相关基因被鉴定，丰富了大豆抗性基因库。

通过对2021年大豆分子标记的研究和应用的总结，发现分子标记的相关研究逐渐遍及大豆多个性状，每年通过测序和关联分析所定位鉴定的基因较多，形成了热潮。不过分子标记在育种中的应用仍存在着一些问题。首先，遗传位点的定位易受环境和研究方法等诸多因素的影响，造成结果存在精确度差的问题。其次，基因的重组会破坏与遗传位点连锁分子标记。再者，大豆的大多数性是由多基因控制的，分子标记对其的设计还存在难度。最后，分子标记的研究在不断深入，但应用于实际的却很少。为了更好地进行基础研究，新颖定位技术的研发必不可少；设计更加牢固的分子标记也是努力的方向；多组学层面上的联合是揭示基因功能最为准确的方法；如何将分子标记辅助育种技术从基础拓展到实际应用需要处理好与传统育种之间的关系。面对作物种植面积、品种退化以及抗性不显著等关键问题，分子标记辅助育种的应用依然是首选，相信随着技术的不断更新，大豆育种工作会更加简捷，育种成效会更加显著。