MTT比色法检测苦瓜MAP30蛋白对5637细胞增殖、MALAT1、HOTAIR及UCA1的影响

杨海霞 张鹏 陆伦 邓秀英 陈艳梅

(遂宁市中心医院药学部，四川 遂宁 629000)

在细胞活性与生长的检测中，噻唑蓝(MTT)比色法的应用频率相对较高，检测原理主要体现在活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为蓝紫色结晶甲臜并沉积于细胞[1]，而在正常状况下，死细胞是无这项功能的。膀胱癌多发生于膀胱黏膜上，是目前临床医学中相对常见、多发的恶性肿瘤之一[2]，治疗方法包括手术切除、放疗、化疗等。近年来的相关研究数据表明，作为一种植物蛋白，MAP30(Momoridica anti-HIV protein of 30KD，MAP30)主要从苦瓜种子中提取，实验证实其有多种生物学活性，可参与抗病毒、抗肿瘤、抗菌等[3]，但由于MAP30属大分子药物，能有效进入细胞的几率较低，而提高其进入细胞的效率对抗肿瘤应用无疑具有十分突出的作用。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在膀胱癌发生、发展、转归过程中均扮演着重要的作用。最新研究发现[4]，肺腺癌转移相关转录因子1(metastasis related transcription factor 1，MALAT1)、lncRNA HOX转录反义RNA(Long-chain non coding RNA Hox transcription antisense RNA,HOTAIR)及膀胱尿路上皮癌相关1(Urothelial carcinomaassociated 1，UCA1)在膀胱癌中均呈高表达，这提示上述三种物质可能是包括膀胱癌在内的恶性肿瘤的生物学标志物之一。苦瓜MAP30蛋白，对人体中的多种肿瘤细胞均有较好的抑制作用，并可促进其凋亡[5]，但与膀胱癌相关的研究却相对较少。因此，本文将在MTT法检测苦瓜MAP30蛋白的基础上探讨苦瓜MAP30蛋白与膀胱癌5637细胞增殖的关系及对MALAT1、HOTAIR及UCA1表达水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 细胞系：膀胱癌5637细胞系(实验样表)均购自中国科学院上海细胞所，而苦瓜则购自本院就近区域的蔬菜批发市场(均属新鲜稚嫩苦瓜)，约500 g。实验菌株：pET-28质粒载体、DH5α克隆菌株及BL21(DE3)表达菌株均为本院自存。试剂：改良型RPMI Medium1640培养基(Gibico公司)，RIPA裂解液(碧云天公司)、DNA凝胶回收试剂盒(捷瑞生物工程有限公司)、质粒小量制备试剂盒(捷瑞生物工程有限公司)、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，Genebase公司)、4%多聚甲醛(上海世泽生物科技有限公司)、MTT(上海世泽生物科技有限公司)。实验仪器：荧光酶标仪(赛默飞公司)、80-2B台式及TGL-16C离心机(上海离心机研究所)、ECP3000电泳仪(北京六一仪器厂)、超低温冰箱(日本三洋公司)、BB5060 CO2培养箱(赛默飞公司)、PCR仪(赛默飞公司)、微孔滤膜(0.22 μm，Bio-Rad公司)、流式细胞仪(Bio-Rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 苦瓜MAP30基因的克隆、表达及纯化 克隆：在成功构建并保存重组质粒EGFP-pET28a及EGFP-HBD-pET28b质粒的基础上将其转化成大肠杆菌感受态细胞BL21菌株后置于培养基中培养(温度：37℃，培养时间：60 min)，然后构建MAP30重组表达载体(带有信号肽的载体：MAP30s-pET28a、MAP30s-HBD-pET28a)，然后以苦瓜果肉基因组DNA为模板进行苦瓜MAP30扩增物序列(表1)进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)扩增处理并电泳(琼脂糖凝胶电泳仪)后进行PCR产物回收，然后将其连接于pMD-19T simple载体上，接着再次进行菌落PCR验证，并在4℃条件下连接过夜。采用限制性内切酶和DNA连接酶将扩增片段克隆至pET-28质粒载体，转化至DH5α感受态细胞进行扩增，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，酶切体系进行鉴定。融合蛋白表达：将上述构建完成的重组质粒表达型感受态细胞(DE3)进行转化处理并提取其单菌落接种(卡那霉素：50 μg/mL)于LB培养基中，过夜培养(温度：37℃，培养时间：16 h)后加入异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside，IPTG)进行诱导表达，离心(离心速率：3000 r/min，离心时间：0.5 h)处理，收集上清及包涵体后进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，最后进行纯化。纯化：用超纯水清洗介质后进行平衡Ni-NTA层析柱处理，并使其pH稳定，待上样完成后用缓冲液A清洗柱体以去除杂蛋白并确保获取无杂质的目的蛋白；然后用超纯水清洗介质至中性后加入20%乙醇保存，4℃保存，接着收集蛋白样品后置于透析液中透析4次，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，并用无菌PCR管分装和置于超低温冰箱(-80℃)中保存备用。

表1 苦瓜MAP30扩增引物序列

1.2.2 5637细胞培养 将冻存的膀胱癌5637细胞取出并快速水浴(42℃)而使其解冻，接着将细胞悬液转入10 mL无菌离心管中离心(离心速率：1000 r/min，离心时间：6 min)处理后去上清并预热处理后转入细胞瓶中CO2培养箱培养1 d至细胞贴壁。加入含小牛血清RPMI 1640培养液复苏培养，待细胞长满后用胰蛋白酶消化，吸管反复吹打至形成单个细胞悬液后进行传代培养或置于液氮中保存备用。

1.2.3 MAP30蛋白对5637细胞增殖影响的检测 按MTT实验检测相关步骤操作，将对数生长期的细胞消化悬液后置入96孔板中并进行过夜(温度37℃，5%CO2细胞培养箱)，培养至贴壁。37℃孵育24 h后去培养箱并加入细胞培养液(MTT溶液20 mL和180 mL无血清)，铺板使细胞调密度至2×103/孔，再次孵育(CO2细胞培养箱，时间4 h)处理后弃孔内培养基并加入二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解150 μL(甲瓒)后置于摇床上振荡10 min，最后读取其OD490吸光值。抑制率计算公式：细胞生长抑制率=(1-处理组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。

1.2.4 MAP30蛋白对5637细胞凋亡的影响检测 将5637细胞接种于96孔板中培养，接着加入不同浓度(0、100、200、400 μg/mL)的MAP30蛋白溶液，以上4种浓度的MAP30溶液各重复5孔，培养时间分别24、48 h。上述实验重复3次。按凋亡检测试剂盒说明书要求检测细胞凋亡率。

1.2.5 MAP30蛋白对lncRNA表达的影响检测 培养5637细胞(24、48 h)并提取(TRIzol试剂)其总RNA。接着将总DNA合成cDNA(Reagents试剂盒逆转录)并检测(检测方法：RT-PCR)lncRNA MALAT-1、HOTAIR、UCA1相对表达(RQ)值，RQ=2-△Ct，△Ct=Ct目标-Ct内参。引物序列见表2。

表2 RT-PCR检测时所用引物序列

1.3 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，不同浓度的MAP30蛋白与5637细胞增殖的抑制与凋亡效能等计数资料用2检验。苦瓜MAP30蛋白对膀胱癌5637细胞lncRNA表达等计量资料用t检验，以表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的MAP30蛋白与膀胱癌5637细胞的抑制与凋亡效能比较 抑制率：膀胱癌5637细胞增殖时所产生的抑制率越高时，MAP30蛋白的浓度也越高，且时间越长，即MAP30蛋白浓度与膀胱癌5637细胞增殖呈正比(P<0.05)。凋亡率：膀胱癌5637细胞凋亡随MAP30浓度递增而逐渐上升，且MAP30浓度(培养48h)为400μg/mL时，膀胱癌5637细胞凋亡率达到最高，MAP30浓度与膀胱癌5637细胞凋亡呈正比(P<0.05)，见图1～3。

图1 不同浓度MAP30蛋白对5637细胞凋亡相关流式图

图2 不同浓度的MAP30蛋白与膀胱癌5637细胞的抑制效能

图3 不同浓度的MAP30蛋白与膀胱癌5637细胞凋亡的影响

2.2 苦瓜MAP30蛋白对膀胱癌5637细胞lncRNA表达的相关性 膀胱癌5637细胞lncRNA MALAT-1、HOTAIR、UCA1表达水平随苦瓜MAP30蛋白浓度的递增而逐渐降低，检测时间为48 h且苦瓜MAP30蛋白浓度为400 μg/mL时上述三项指标的表达水平均显著低于检测24、48 h时的其他苦瓜MAP30蛋白浓度(P<0.05)，见图4～6。

图4 苦瓜MAP30蛋白对膀胱癌5637细胞lncRNA MALAT-1表达的影响

图5 苦瓜MAP30蛋白对膀胱癌5637细胞lncRNA HOTAIR表达的影响

图6 苦瓜MAP30蛋白对膀胱癌5637细胞lncRNA UCA1表达的影响

3 讨论

近年来的研究表明，以微小RNA(Micro RNA，miR)为典型的非编码RNA(non-coding RNA，ncRNAs)在各种恶性肿瘤的发生、发展和转归中具有重要作用[6]。有研究表明，膀胱癌的发生、发展、转归及预后均与miR-1、miR-499和miR-208的针对性调控相关[7]。苦瓜MAP30蛋白是常见的真核基因之一，生物活性良好，作为一种Ⅰ型核糖体失活蛋白，不仅抗病毒、抗菌、抗肿瘤活性较强，且在诱导肿瘤细胞凋亡也有较好的特异性，且对未感染的正常二倍体细胞也几乎无毒性，耐药性极低[8-11]。研究认为，MAP30蛋白对肝癌、骨髓癌、乳腺癌等恶性肿瘤及黑色素癌、大肠癌、食管癌等的肿瘤细胞的增殖及凋亡均有较好的抑制和诱导作用[12-13]，但MAP30蛋白与膀胱癌是否存在相关性的研究数据却鲜有报道。

相关研究证实，肿瘤细胞的凋亡显然受lncRNA的调控[14-15]，MALAT-1表达与肿瘤严重程度呈正相关，可能通过增加HMGB1蛋白表达，促进凋亡基因自噬，从而抑制细胞凋亡[16]。HOTAIR可增加自噬在机体损伤中的机制，而MiR-20b-5p又可通过靶向ATG7抑制细胞自噬，而HOTAIR又可将MiR-20b-5p调控为内源性海绵，这又无疑提升了ATG7的表达水平[17]。UCA1作为一种新型的调控因子，在各种癌症的发生、发展过程中均发挥着重要作用，其水平表达与病理分级、临床分期和复发关系等密切相关[18-19]。研究发现，UCA1mRNA表达在膀胱癌组织中的阳性表达率明显高于正常膀胱组织[20]，提示，下调UCA1对促进膀胱癌组织中的肿瘤细胞的凋亡和抑制5637细胞的增殖均有极大帮助。

本研究结果表明，苦瓜MAP30蛋白对膀胱癌5637细胞增殖的抑制和凋亡诱导方面均有较好的效果。提示膀胱癌5637细胞的增殖与凋亡同样受苦瓜MAP30蛋白的调控。其机制可能如下：①作为一种常见的核糖体失活蛋白，苦瓜MAP30蛋白可通过抑制膀胱癌患者的肿瘤细胞中的核糖体活性而起到抑制细胞蛋白合成之目的，最终对肿瘤的生长、恶化及细胞凋亡其抑制与诱导。②苦瓜MAP30蛋白的抗癌作用可通过上调机体中的黏附分子CD34表达，继而改变肿瘤细胞的粘附性。③苦瓜MAP30蛋白具有抗病毒和抗菌作用。④苦瓜MAP30蛋白可对ERK1、AKT活化进行抑制，从而促进NF-kB通路活性被抑制，这同样有利于膀胱癌肿瘤细胞的凋亡。除此之外，近年来的研究也证实，苦瓜MAP30蛋白在恶性肿瘤中的机制还包括降低线粒体膜电位而促进细胞色素C的释放，影响突变型p53基因表达及上调凋亡前期蛋白Bax和下调抗凋亡蛋白Bcl-2的转录和表达等[21]，但这些机制仍需进一步研究提供佐证。

本研究表明，膀胱癌5637细胞lncRNA MALAT-1、HOTAIR、UCA1表达水平随苦瓜MAP30蛋白浓度的递增而逐渐降低，检测48 h且苦瓜MAP30蛋白浓度为400 μg/mL时，膀胱癌5637细胞lncRNA 中的MALAT-1、HOTAIR、UCA1表达水平均显著低于检测24、48 h时的其他苦瓜MAP30蛋白浓度(P<0.05)，提示上述三项指标均受苦瓜MAP30蛋白的调控。同时随着MAP30蛋白作用浓度提高，5637细胞MALAT-1、HOTAIR和UCA1等的lncRNA表达均随着苦瓜MAP30蛋白浓度的增高而逐渐下降，提示MAP30可能通过抑制MALAT-1、HOTAIR和UCA1的增殖和诱导其凋亡。

4 结论

苦瓜MAP30蛋白对膀胱癌5637细胞增殖的抑制和凋亡诱导方面有较好的效果，且可下调MALAT-1、HOTAIR、UCA1表达水平。