余欢迎,高海燕,金传山,张亚中,王桐生,张 伟,许凤清,柳春风
(1.安徽中医药大学,安徽 合肥 230012;2.中药饮片制造新技术安徽省重点实验室,安徽 合肥 230012;3.安徽省食品药品检验研究院,安徽 合肥 230051;4.金寨润元生物科技有限公司,安徽 六安 237300)
黄精味甘平,归脾、肺、肾经,具有补气养阴、健脾、润肺、益肾的功效,临床常用于治疗肾精亏虚、腰膝酸软、内热消渴等证。传统炮制理论认为,黄精炮制是为去除麻舌的口感和达到防止朽坏的目的,从而达到“滋阴补益”的作用。《医林篡要·药性》也有记载“生黄精,实有辛莶之味,戟人喉吻,惟蒸晒久,庶几补养滋肾耳”,表明黄精经反复蒸晒后可增强滋阴益肾的功效。近年来关于黄精多糖类成分的药理作用研究较多,但对于黄精炮制前后的滋阴益肾作用比较研究鲜有报道。
现行《中华人民共和国药典》对酒黄精炮制工艺的描述过于笼统,缺乏具体的工艺参数,难以保证酒黄精饮片的规范性与安全性。刘玲通过析因和正交试验,优选出酒黄精最佳炮制工艺为蒸制4次,每次蒸制3 h,闷润3 h。课题组前期研究也发现,黄精在蒸至四蒸时已符合《中华人民共和国药典》的质量要求,且多糖含量趋于稳定,利于人体吸收的小分子糖类总量也达到峰值,可能成为黄精炮制的拐点和终点。故本实验拟以多花黄精生品、两蒸、四蒸及九蒸样品为研究对象,通过建立糖皮质激素致肾阴虚大鼠模型,比较生品及不同蒸、烘次数酒制品发挥传统滋阴益肾功效的差异,为酒黄精炮制工艺的优选及临床的合理应用提供一定的参考依据。
1.1 动物 70只SD健康雄性大鼠,(200±20)g,SPF级,购自邳州市东方养殖有限公司[生产许可证号:SCXK(苏)2017-0003],动物质量合格证号:202107583。动物福利和实验过程均遵循安徽中医药大学动物实验研究中心伦理委员会规定。
1.2 药物与试剂 黄精购自安徽省金寨县森沣农业科技有限公司,经安徽中医药大学刘守金教授鉴定为多花黄精Polygonatum
cyrtonema
Hua的干燥根茎。氢化可的松注射液(批号20201101):山西省芮城科龙兽药有限公司;六味地黄丸(批号210130):仲景宛西制药股份有限公司;黄酒:安徽省海神黄酒集团有限公司;环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)试剂盒(批号 20210501-30440A)、环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)试剂盒(批号 20210501-30439A)、皮质酮(corticosterone,CORT)试剂盒(批号 20210501-30679C):泉州睿信生物科技有限公司;肌酐(creatinine,Cr)测定试剂盒(批号 20210415-C011-2-1):南京建成生物科技有限公司。1.3 仪器 TGL16M台式高速冷冻离心机:上海卢湘仪离心机仪器有限公司;RT-6100型酶标仪:深圳雷杜生命科学股份有限公司;HT-111B型恒温摇床:上海赫田科学仪器有限公司;RM2016型病理切片机:上海徕卡仪器有限公司;Nikon Eclipse E100型正置光学显微镜:日本尼康公司。
2.1 黄精样品制备
2.1.1 生黄精 除去杂质,洗净,略润,切厚片,干燥。
2.1.2 酒黄精 取净制后的生黄精适量,洗净,用黄酒拌匀(每100 kg黄精加黄酒20 kg),闷润至吸尽,放蒸箱内隔水蒸3 h,取出60 ℃恒温干燥3 h。如此重复操作2、4、9次,得两蒸、四蒸、九蒸样品,切厚片,干燥。
2.2 药液制备 黄精生品及不同炮制品水煎液的制备:取一定量黄精不同炮制品饮片,加10倍量水浸泡0.5 h,煎煮两次,每次1 h,滤过,合并2次滤液,浓缩,得样品水煎液(含生药0.54 g/mL)。六味地黄丸溶液制备:取适量六味地黄丸,加入50 mL蒸馏水制成混悬液(含生药0.324 g/mL),现配现用。
2.3 分组给药及模型复制 70只SPF级雄性SD大鼠,适应性饲养7 d后,随机分成空白组、模型组、阳性药组(六味地黄丸组)、生品组(黄精生品组)、两蒸组(黄精两蒸组)、四蒸组(黄精四蒸组)、九蒸组(黄精九蒸组)。肾阴虚证大鼠模型的制备方法参照文献[10],各给药组大鼠每日上午灌胃给药1次,连续11 d,给药容积为10 mL/kg,空白组及模型组给予等量蒸馏水。于实验的第8—11天下午,除空白组外其余各组均灌胃氢化可的松注射液(50 mg/kg),空白组灌胃等量蒸馏水。第12天,将大鼠全部麻醉后进行腹主动脉取血,采血完成后,迅速分离大鼠两侧肾上腺组织。黄精的药典推荐剂量为15 g/d,六味地黄丸的给药剂量为9 g/d,按照体表面积法计算等效剂量,给药剂量为4倍等效剂量,即黄精各样品给药剂量为5.4 g/kg,六味地黄丸给药剂量为3.24 g/kg。
2.4 一般状况观察 于给药及模型复制过程中观察大鼠的精神状态、毛色、活动量及大小便等一般情况的变化。
2.5 体质量、体温测定 于实验第7天(模型复制前)、第11天(末次给药后)测定大鼠体质量、体温,并记录。
2.6 血液指标测定 末次模型复制后大鼠禁食不禁水12 h,于第12天腹主动脉取血。将取好的血液放置30 min,以3 000 r/min离心15 min,将分离出的血清和血浆分装冻存,待测。严格按照试剂盒测定方法进行实验,检测大鼠血浆中cAMP、cGMP含量以及血清中CORT、Cr含量。
2.7 大鼠肾上腺病理观察 将各组大鼠肾上腺组织用4%甲醛固定,经过常规石蜡包埋、切片与贴片后,用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色,于光学显微镜下观察肾上腺组织的病理学变化。
3.1 一般状况 在预防性给药1周的过程中,各组大鼠精神状态正常,行动敏捷,体质量增长平稳。在灌胃氢化可的松2 d后,模型组大鼠体质量下降明显,出现体温升高、烦躁不安、竖毛、拱背、毛色无华、尿量增加、小便色黄、大便干结色黑等肾阴虚的症状。各给药组上述症状较模型组均有一定程度改善。模型复制过程中模型组和生品组大鼠各死亡1只。
3.2 各组大鼠体质量、体温比较 与空白组比较,模型组大鼠的体质量显著减少、体温显著升高(P
<0.
05)。与模型组比较,两蒸组、四蒸组大鼠体质量显著增加(P
<0.
05),阳性药组、生品组及两蒸组大鼠体温显著降低(P
<0.
05)。其余各组大鼠体质量、体温的改善不明显(P
>0.
05)。见表1。表1 各组大鼠体质量及体温比较
3.3 各组大鼠血浆cAMP、cGMP水平及其比值比较 与空白组比较,模型组大鼠血浆cGMP的水平显著降低(P
<0.
05),cAMP水平及cAMP/cAMP比值显著上升(P
<0.
05)。与模型组比较,各给药组大鼠血浆cAMP的水平均显著降低(P
<0.
05);除生品组外,其他各给药组大鼠血浆cGMP的水平显著升高(P
<0.
05),cAMP/cGMP的比值显著降低(P
<0.
05)。与生品组比较,四蒸组大鼠血浆cGMP水平显著升高(P
<0.
05)。见表2。表2 各组大鼠血浆cAMP、cGMP水平及其比值比较
3.4 各组大鼠血清CORT及Cr水平比较 与空白组比较,模型组大鼠血清CORT、Cr水平显著升高(P
<0.
05)。与模型组比较,除生品组外,其余各给药组大鼠血清CORT、Cr水平均显著降低(P
<0.
05)。与生品组比较,四蒸、九蒸组大鼠血清CORT、Cr水平均显著降低(P
<0.
05)。见表3。表3 各组大鼠血清CORT、Cr水平比较
3.5 各组大鼠肾上腺病理变化情况比较 与空白组比较,模型组肾上腺发生萎缩,球状带以及束状带的结构不清晰,细胞排列紊乱,较多实质细胞气球样变性,细胞肿胀,核居中,胞质空泡化,较多窦状隙瘀血扩张;阳性药组球状带、束状带及网状带的结构清晰,细胞排列有序,偶见实质细胞水样变性,肾上腺组织形态与空白组最为接近;两蒸组、四蒸组及九蒸组球状带、束状带及网状带的结构尚清晰,细胞排列较整齐,少见实质细胞气球样变性,细胞肿胀,胞质空泡化;生品组球状带、束状带及网状带的结构不清晰,细胞排列紊乱,较多实质细胞气球样变性,细胞肿胀,核居中,胞质空泡化。观察结果提示:模型组大鼠肾上腺组织细胞损伤较为明显,阳性药组及各黄精炮制品组对受损的肾上腺组织均有一定程度的改善作用,生品组对肾阴虚模型大鼠的肾上腺组织无明显改善作用。见图1。
图1 各组大鼠肾上腺组织病理变化情况比较(HE染色,10×20倍)
本研究选用短期大剂量给予糖皮质激素的方法复制肾阴虚证大鼠模型。糖皮质激素类药物属于阳刚之品,过量使用,易伤阴,导致肾阴虚。研究发现,灌胃氢化可的松后,大鼠逐渐出现体质量减轻、大便干结、易惊易怒、毛发干枯无光泽等现象,与肾阴虚的临床症状基本一致,表明肾阴虚大鼠模型复制成功。其中,生品、两蒸组大鼠体温显著降低,两蒸、四蒸组大鼠体质量显著增加,其余各组不明显,这可能与炮制过程中药性的改变有关。古人认为,黄精经反复蒸晒后可以达到转苦为甘、寒性变平的效果,而黄精生品的偏性可能为其降低大鼠体温的基础,随着炮制过程中偏性被逐渐消除,性味转为甘、平,继而发挥补益功效,四蒸组、九蒸组降低体温的作用也就逐渐减弱。
cAMP和cGMP作为细胞内参与调节物质代谢和生物学功能的重要物质,其作用既相互拮抗,又相互协调维持着整个生命过程。有研究表明,肾阴虚患者表现为血浆cAMP水平升高、cGMP水平降低,同时cAMP与cGMP比值也显著升高。血清中CORT水平的变化可以反映出肾阴虚证肾上腺皮质功能的状态,故研究中常用作肾阴虚模型的评价指标之一。此外,有研究发现,肾阴虚证除表现出一般的阴虚症状外,还伴随血清Cr水平的升高。本研究结果表明,不同炮制品能升高大鼠血浆cGMP水平,降低cAMP、cAMP/cGMP比值及血清CORT、Cr水平;生品能降低大鼠血浆cAMP水平。炮制品和生品均能改善肾阴虚大鼠症状。其中,炮制品的调节作用显著优于生品,可能由于黄精经反复蒸晒消除了具有刺激性的黏液质,使其滋而不腻,同时借助黄酒的提升作用,增强其滋阴益肾的作用。陈嘉谟在《本草蒙荃》中提出“凡药制造,贵在适中,不及则功效难求,太过则气味反失”,强调了炮制程度对临床功效的重要性。黄精在炮制过程中多糖类成分会大量水解成利于人体吸收的小分子糖类成分,随着炮制过程的推进,小分子糖类又会和氨基酸类成分发生美拉德反应,使有效成分损失,这可能是九蒸样品在改善肾阴虚大鼠药效相关指标方面稍弱于四蒸样品的主要原因。四蒸样品的小分子糖类成分含量高,更易于人体吸收,有利于有效成分的充分发挥,从而增强其补益作用。
本研究发现,黄精不同炮制品均能一定程度改善肾阴虚大鼠症状,其作用机制可能与其改善环核苷酸系统、下丘脑-垂体-肾上腺轴激素水平及肾上腺组织的保护作用有关。黄精酒制后滋阴益肾作用增强,临床在预防及改善肾阴虚相关疾病时推荐使用酒制品。四蒸黄精在改善肾阴虚大鼠环核苷酸系统、下丘脑-垂体-肾上腺轴激素水平及肾上腺组织形态方面稍优于其他炮制品,为课题组前期优选出的酒黄精产业化生产工艺的可行性提供了实验依据,后续将对黄精发挥滋阴益肾作用的物质基础进行更深入的研究,以期揭示黄精炮制增效的科学内涵。