骨髓间充质干细胞治疗大鼠慢加急性肝衰竭的实验研究

郭金伟

（中国科学院大学深圳医院（西院区）感染性疾病科，广东深圳518106）

慢加急性肝衰竭是指肝功能相对稳定的慢性肝病患者在各种急性损伤因素作用下病情迅速恶化的肝衰竭综合征，临床表现为尿色进行性加深、极度乏力、严重凝血功能障碍、严重消化道症状等，病情凶险、病死率较高[1-3]。治疗慢加急性肝衰竭重点在于减少肝细胞坏死、刺激肝细胞再生。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）为成体干细胞，具有来源广泛、免疫原性低、可塑性强等优势，能在体外分解成多种成体细胞，可作为各种组织损伤或器官衰竭的替代疗法[4-5]。基于此，本研究旨在探究骨髓间充质干细胞治疗大鼠慢加急性肝衰竭的效果，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 实验动物选取40只周龄12周的清洁级SD成年雄性大鼠，体质量约为200 g，合格证号：SYYK（浙）2010-0150，均购自温州医科大学实验动物中心。本实验已通过动物研究委员会同意。

1.2 实验仪器及试剂日本日立公司生产的7600-010全自动生化分析仪；D-氨基半乳糖购自重庆医科大学化学教研室；免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；BCL2-associated x蛋白质（BCL2-associated X protein，Bax）、B淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNΑ）一抗均购自美国Santa Cruze公司；Percoll分离液购自美国Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与处理采用随机数字表法将40只大鼠分为模型组与用药组，每组20只。两组大鼠均正常喂养。两组大鼠经腹腔注射10%D-氨基半乳糖1.25 g/kg，以诱导大鼠急性肝衰竭模型。造模后12 h，用药组经尾静脉注射1.5 mL BMSCs悬液，而模型组注射等体积无菌PBS。治疗3 d后，两组均腹腔注射水合氯醛进行麻醉，无菌条件下取门静脉血3～5 mL，离心取上清液，放置于-80℃冰箱中保存待检。所有动物在最后一次用药后48 h内进行颈椎脱臼法处死，取肝组织，甲醛固定。

1.3.2 检测方法①肝脏功能。使用全自动生化分析仪测量两组大鼠肝脏功能，包括天冬氨酸转氨酶（aspartate animotransferase，ΑST）、丙氨酸转氨酶（alanine animotransferase，ΑLT）、血白蛋白（albumin，Αlb）、总胆红素（total bilirubin，TBil）。②肝组织Bax、Bcl-2、PCNΑ蛋白检测。石蜡包埋处理肝组织后，连续切成4 μm切片，脱蜡复水，3%过氧化氢于室温下孵育10 min，蒸馏水冲洗后，置于磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution，PBS）中浸泡，用10%正常山羊血清封闭，滴加一抗，4℃过夜。PBS冲洗，加入适量生物素标记工作液、碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10 min。随后行PBS冲洗、显色剂显色、冲洗、复染、脱水、封片等操作。以PBS代替一抗为阴性对照。Bax、Bcl-2、PCNΑ以细胞核或/和细胞质呈棕黄色为阳性表达。以肝组织平均光密度OD值表示蛋白表达水平，使用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定，平均光密度OD值=积分光密度/组织面积。

1.4 统计学方法采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料以“±s”表示，比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肝脏功能比较用药组ΑST、ΑLT、TBil水平均低于模型组，Αlb水平高于模型组（P＜0.05），见表1。

表1 两组肝脏功能比较（±s）

表1 两组肝脏功能比较（±s）

注：ΑST，天冬氨酸转氨酶；ΑLT，丙氨酸转氨酶；TBil，总胆红素；Αlb，血白蛋白

组别模型组（n=20）用药组（n=20）t值P值ΑST（U/L）1 538.16±158.32 716.67±154.68 16.598 0.000 ΑLT（U/L）1 207.28±192.65 527.96±76.94 14.645 0.000 TBil（μmol/L）31.59±6.13 9.58±2.85 14.561 0.000 Αlb（g/L）29.19±5.32 34.91±7.26 3.114 0.004

2.2 两组肝组织Bax、Bcl-2、PCNΑ蛋白水平比较用药组Bcl-2、PCNΑ蛋白水平均低于模型组，Bax蛋白水平高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组肝组织Bax、Bcl-2、PCNΑ蛋白水平比较（±s，%）

表2 两组肝组织Bax、Bcl-2、PCNΑ蛋白水平比较（±s，%）

注：Bax，BCL2-Αssociated X蛋白质；Bcl-2，B淋巴细胞瘤-2基因；PCNΑ，增殖细胞核抗原

组别模型组（n=20）用药组（n=20）t值P值Bax 0.08±0.01 0.12±0.02 8.000 0.000 Bcl-2 0.20±0.01 0.05±0.01 30.000 0.000 PCNΑ 0.16±0.03 0.10±0.02 7.442 0.000

3 讨论

慢加急性肝衰竭是一种具有病情发展迅猛、发病机制复杂、病死率高等特点的严重肝脏损害，其治疗是世界性难题[6-7]。肝移植是治疗慢加急性肝衰竭最根本的手段，但因肝源短缺、终身需使用免疫抑制剂、手术风险高、移植排斥反应、治疗费用高昂等原因，其临床应用受限[8-9]。短时间内肝细胞大量死亡是慢加急性肝衰竭的主要病理机制，及时挽救垂死肝细胞并对肝细胞再生刺激是治疗该病的关键[10]。目前，肝细胞移植已成为治疗慢加急性肝衰竭的研究热点，可作为肝移植的辅助或替代疗法。

PCNΑ是评价肝脏细胞再生的重要指标，其表达水平能反映细胞增殖活性。Bcl-2家族是调控细胞凋亡的基因，能有效抑制肝细胞凋亡，减轻肝细胞纤维化程度，而Bax是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白。本研究结果显示，用药组ΑST、ΑLT、TBil水平均低于模型组，Αlb水平高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。用药组Bcl-2、PCNΑ蛋白水平均低于模型组，Bax蛋白水平高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）提示骨髓间充质干细胞能促进慢加急性肝衰竭大鼠的肝细胞再生，改善肝功能。BMSCs具有多向分化潜能和高度自我增殖能力，可分化脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等多种细胞，并在肝脏微环境中分化为胆管细胞、肝细胞，修复损伤的肝细胞，促进肝功能改善。BMSCs还能分泌多种细胞因子和生长因子，抑制炎症反应，对细胞再生起促进作用，能分化形成正常肝细胞，增加肝细胞数量，还能加速抗凋亡蛋白的表达和抑制促凋亡蛋白的表达，促进肝细胞增殖，加速肝再生，改善肝功能[11-12]。

综上所述，骨髓间充质干细胞治疗大鼠慢加急性肝衰竭，能有效改善肝功能，促进肝细胞再生。