蛞蝓多糖的鉴定及其含量测定*

韦秀莎，黄金石，吴娅妮，高雨桐，陈 铭，黄仁彬

（广西医科大学药学院，南宁 530021）

蛞蝓（Limax）属腹足类腹足纲蛞蝓科，一种有肺的软体动物，俗称“鼻涕虫”。《神农本草经》卷四下品、《本草纲目》、《中药大辞典》等中医药书籍对蛞蝓性味归经、功效主治均有记载，主治蜈蚣咬伤、痔热肿痛、脚胫烂疮、清热祛风、消肿解毒、破痰通经、中风歪僻、筋脉拘挛、惊痫、喘息、喉痹、咽肿、痈肿、丹毒、经闭、症瘕等。药理研究发现，蛞蝓提取物具有抗肿瘤、平喘等多方面的作用，且其毒性较低[1-3]。现代研究表明，蛞蝓含蛋白、多糖等多种成分。陈亮等[4]研究发现，蛞蝓抗癌有效成分不是蛋白，有可能是多糖。但目前缺乏对水溶性蛞蝓多糖的结构及其含量的研究，因此，本组对水提法获得的蛞蝓多糖进行鉴定，初步确定其结构，测定其含量，为研究蛞蝓多糖的药理作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试药和仪器

蛞蝓，采自广西百色，经广西中医药研究院赖茂祥教授鉴定，确定为腹足类腹足纲蛞蝓科蛞蝓（Limax）。低温高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；倒置显微镜（日本Olympus 公司）；万分之一电子天平（梅特勒一托利多公司）；紫外可见分光光度计（上北京谱析TV-1901）；傅里叶红外光谱仪（美国珀金埃尔莫Spectrum 100）。所用到的化学试剂均为分析纯。

1.2 蛞蝓的性状鉴别与显微鉴别[5]

根据《中国药典》2020版的项目要求第15项，对本次实验采集的蛞蝓全虫大小、颜色、器官、气味等特征进行性状观察。将蛞蝓全虫置于4%甲醛溶液中固定，24 h后，进行标本修剪、漂洗、脱水、透明、透蜡、包埋、切片与展片、烘片，中性树脂封片，苏木精—伊红（HE）染色后，通过显微镜对蛞蝓横切面组织形态进行观察。

1.3 蛞蝓多糖的提取

称取蛞蝓全虫1 kg，液料比2∶1加入蒸馏水进行破壁匀浆，4 000 r/min低温离心15 min，弃上层漂浮物和下层沉淀，得粗提液，加80%乙醇醇沉24 h，离心，收集沉淀，低温真空干燥，研磨均匀，过40 目筛，得蛞蝓粗多糖[6]。

1.4 蛞蝓多糖的鉴定试验[7]

取200 mg的蛞蝓多糖溶解于10 mL蒸馏水中，超声助溶30 min，得蛞蝓多糖溶液。采用Molish 反应和斐林反应鉴定蛞蝓多糖。Molish 反应：分别取1 mL 的蒸馏水阴性对照溶液和蛞蝓多糖溶液于试管中，然后加4滴α-萘酚试剂，摇匀后沿管壁缓缓滴加浓硫酸1 mL，观察液面交界处是否有紫环。斐林反应：分别取1 mL的蒸馏水阴性对照溶液和蛞蝓多糖溶液于试管中，再分别往试管滴加事先配好的斐林试剂1 mL，沸水浴10 min，观察试管底部是否有砖红色沉淀。

1.5 蛞蝓多糖的组成分析[8-9]

样品a溶液的制备：称取蛞蝓全虫1 kg，液料比2∶1 加入蒸馏水进行破壁匀浆，4 000 r/min 低温离心15 min，弃上层漂浮物和下层沉淀，得粗提液，冷冻干燥得样品a 溶液。样品b 溶液的制备：同“1.3项”。样品酸水解：于20 mL 具塞试管中，分别加入125 mg 样品a 溶液和样品b 溶液，后加入10 mL 2 mol/L的硫酸，混匀，置于105 ℃的烘箱水解4 h，冷却至室温，加入碳酸钡中和水解液，然后离心20 min(10 000 r/min)，吸取上清液，过滤，分别得样品a、b水解液，置于4 ℃冰箱保存备用。标准糖溶液的制备：分别称取100 mg的L-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-核糖、D（+）-无水葡萄糖对照品，加10 mL水，配制成10 mg/mL 的标准单糖溶液。分别吸取0.5 μL 标准糖溶液，3 μL 样品a、b 水解液点样于同一硅胶G 薄层板上，以正丁醇—甲醇—氯仿—冰乙酸—蒸馏水（25∶9∶5∶3∶3）作为展开剂展开，取出后待薄层板晾干，喷以苯胺—二苯胺磷酸溶液，105 ℃加热至斑点清晰，于日光下检视。

1.6 蛞蝓多糖红外光谱结构鉴定[6,10]

称取0.5 mg蛞蝓多糖样品，与110 mg溴化钾研磨成粉末，混匀，按照仪器条件进行测定。

1.7 含量测定[11-15]

1.7.1 对照品与供试品的制备 对照品溶液的制备：精密称取葡萄糖对照品1.0 mg，加蒸馏水定容至10 mL，得浓度为0.1 mg/mL 的葡萄糖对照品溶液。供试品溶液的制备：称量50 mg蛞蝓多糖，加蒸馏水定容至10 mL，超声30 min，过滤，量取滤液1 mL，定容至10 mL，备用。

1.7.2 测定波长的选择 以蒸馏水为空白，取葡萄糖对照品与样品溶液按标准曲线“1.7.4项”操作，于400～600 nm波长范围内扫描。

1.7.3 显色条件的考察 6%苯酚用量考察：分别在7个试管内加入对照品1.0 mL，逐管加入6%苯酚溶液0.6 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL、1.1 mL、1.3 mL，摇匀，迅速加入5 mL 浓硫酸，沸水浴15 min，冷却，测定波长485 nm处的吸光度值。浓硫酸用量考察：分别在5 个试管内加入对照品1.0 mL、6%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，逐管迅速加入浓硫酸3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、7.0 mL，沸水浴15 min，冷却，测定波长485 nm 处的吸光度值。水浴温度考察：分别在5 个试管内加入对照品溶液1.0 mL、6%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，分别于水温为25 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃条件下反应15 min，冷却，测定最大波长485 nm 处的吸光度值。显色时间的考察：分别在4 个试管内加入对照品溶液1.0 mL、6%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，分别于沸水反应15 min、30 min、45 min、60 min，冷却，测定485 nm处的吸光度值。

1.7.4 标准曲线的制备 精密吸取葡萄糖对照品0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL、0.9 mL、1.0 mL，用蒸馏水补足体积至1 mL，加入6%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速精密量取5 mL 浓硫酸滴加入试管，沸水浴15 min，冷却。测定波长485 nm处的吸光度值。

1.7.5 方法学考察 稳定性试验：取一份蛞蝓多糖，同“1.7.1 项”法制备供试品，分别于0 min、30 min、60 min、90 min、120 min 同“1.7.4 项”法测定波长485 nm 处吸光度值，并计算RSD 值。重复性试验：取6份同一批次蛞蝓多糖，同“1.7.1项”法制备供试品，同“1.7.4 项”法测定485 nm 波长处的吸光度，并计算RSD 值。精密度试验：精密称定50 mg蛞蝓多糖，同“1.7.1 项”法制备供试品，同“1.7.4 项”法在485 nm波长处连续重复测定6次吸光度值，并计算RSD 值。加样回收率：按表2 精密称取6 份已知多糖含量的蛞蝓多糖，同“1.7.1项”法制备成供试品溶液，分别按表2加入不同含量的葡萄糖标准品，同“1.7.4项”法测定485 nm波长处的吸光度，根据吸光度值，计算得平均回收率。

1.7.6 蛞蝓多糖含量测定 取1 mL 供试品溶液，同“1.7.4项”法在485 nm波长处测定吸光度，根据吸光度值计算以葡萄糖计的多糖百分含量。

2 结果

2.1 蛞蝓性状鉴别与显微鉴别

蛞蝓呈长梭状，两头小，中间大，体长30～55 mm，体宽6～12 mm；体表呈灰褐色，同时伴有零星又细小的褐色斑点，体表光滑有黏液；头部有两对触角，前端一对各有眼一个，后端一对较长，触角可以自由伸缩；其右侧附近有椭圆形生殖孔，气腥味咸，见图1。通过显微镜对蛞蝓横切面组织形态进行观察，可以看到蛞蝓最外层为表皮组织，紧贴着是大量的粘液腔，还有大而散列的消化腔，泄殖腔器官明显，见图2。

图1 蛞蝓外观图

图2 蛞蝓HE染色图（×200）

2.2 蛞蝓多糖的鉴定试验

蒸馏水的Molish 反应虽然有分层，但无紫环，而蛞蝓多糖液面交界处有清晰可见的紫环；蛞蝓多糖的斐林反应有明显有砖红色沉淀，而蒸馏水的斐林反应呈现与斐林试剂相同的颜色，无沉淀，提示提取物是含有还原糖的多糖，见图3。

图3 蛞蝓多糖的鉴定试验

2.3 蛞蝓多糖的组成分析

通过薄层色谱分析蛞蝓多糖的单糖成分，观察到蛞蝓多糖主要由葡萄糖和半乳糖组成，见图4、表1。

表1 蛞蝓多糖水解物和标准单糖的Rf值

图4 蛞蝓多糖薄层色谱图

2.4 蛞蝓多糖红外光谱结构鉴定

该样品在4 000.00～600.00 cm-1区域内具有多糖类物质的一般特征。3 420.17 cm-1附近的强吸收峰是糖分子中—OH 的伸缩振动吸收峰；2 961.37 cm-1和2 930.63 cm-1分别为C—H 的2 个伸缩振动吸收峰；1 648.05 cm-1处的强吸收峰说明蛞蝓多糖含有糖醛酸；1 545.63 cm-1处出现振动吸收是N—H键的弯曲振动；1 401.23 cm-1处吸收峰为=CH2的变形吸收峰；1 385.24 cm-1处的吸收峰是C—H 变角振动峰；1 240.15 cm-1处吸收峰是C—O 伸缩振动峰；在1 077.69 cm-1处的吸收峰是吡喃糖环羟基的变角振动吸收峰；929.12 cm-1处吸收峰说明含有α和β-吡喃环型糖苷键，见图5。以上结果表明，蛞蝓多糖是含有吡喃环型糖苷键和酰胺键的酸性多糖。

图5 蛞蝓多糖红外光谱图

2.5 含量测定

样品和对照液的最大吸收波长均为485 nm，因此本次试验选择485 nm为测定波长，见图6。随着6%苯酚的用量增加，吸光度值先升高后降低，当6%苯酚用量为1.0 mL 时，吸光度达到峰值，因此，本次实验6%苯酚的用量为1.0 mL；随着浓硫酸的用量增加，吸光度值先升高后降低，当浓硫酸用量为5.0 mL 时，吸光度达到峰值，因此，本次实验浓硫酸选择的用量5.0 mL；在40～80 ℃的吸光度值变化趋于平缓，在100 ℃时，吸光值达到峰值，故本次实验选择的水浴温度为100 ℃；随着反应时间的延长，吸光度值呈下降趋势，故本次实验选择的沸水浴反应时间为15 min，见图7。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程式A=0.0104C-0.0305（R2=0.9994）。在方法学考察中，稳定性试验RSD 值为0.10%（n=6），重复性试验RSD值为1.75%（n=6），精密度试验RSD 值为0.08%（n=6），加样回收率为98.70%，RSD为1.13%（表2）。以葡萄糖计蛞蝓多糖的平均含量为18.47%。

表2 加样回收试验结果n=6

图6 葡萄糖对照品与样品的波长扫描图

图7 显色条件的考察

3 讨论

在进行多糖的鉴别实验前，先对蛞蝓药材进行性状鉴别，显微鉴别，保证药材的可靠性。多糖的常用鉴别方法有Molish 和斐林反应。Molish 反应虽不具有专属性，但可鉴别药品中是否含有糖类，斐林反应可以鉴别药品中是否含有还原糖，根据实验结果得知提取物含有还原糖的多糖。薄层色谱实验过程中，为了寻找合适的鉴别条件，实验前期对展开系统、展开距离、耐用性进行了考察，最终确定展开条件为：展开剂为正丁醇—甲醇—氯仿—冰乙酸—蒸馏水（25∶9∶5∶3∶3）；上行展开距离为8 cm，选择硅胶G板为薄层板、苯胺—二苯胺磷酸为显色剂，日光下检视，25 ℃条件下跑板。在多糖的水解实验前期探索了氢氧化钠，强氧化钡，碳酸钡的中和效果，发现碳酸中和得到的斑点比较集中清晰。用碳酸钡中和水解液，容易降低单糖的浓度，只有含量高的单糖斑点易显现出来，为了避免这种情况发生，本次实验选择了2 种样品水解液进行多糖组成成分分析，最终确定蛞蝓多糖主要由半乳糖和葡萄糖组成。红外光谱技术在中药的鉴别中非常重要，本研究通过傅里叶红外光谱仪检测，证实提取物质含有吡喃环型糖苷键和酰胺键的酸性多糖。在测定多糖含量前期，已经对6%苯酚的用量，硫酸的用量，反应温度，显色时间进行考察，最终得出6%苯酚用量为1 mL，浓硫酸用量为5 mL，显色时间为15 min，显色温度为100 ℃为最佳反应条件。选择苯酚—硫酸法测定蛞蝓多糖含量，因为该法简便，且重复性、稳定性良好。

本研究先用观察法、HE 染色法对蛞蝓药材进行鉴别，再用molish 反应、斐林反应、薄层色谱法，傅里叶变换红外光谱法和苯酚—硫酸法对蛞蝓多糖进行鉴别、组成、结构和含量测定，可为将来研究蛞蝓多糖的结构以及药理作用提供参考。