菌核生枝顶孢次生代谢物对黑麦草保护酶活性的影响

刘新　宋春艳　牟嘉欣　刘恺迪　王桂清

摘要：为开发枝顶孢生防制剂，以黑麦草为靶标植物，采用比色法分析菌核生枝顶孢次生代谢物对黑麦草保护酶活性的影响。结果表明，代谢物对黑麦草体内可溶性蛋白含量和PAL酶、SOD酶活力主要表现为抑制作用，对EST酶活力表现为促进作用;对PPO酶活力则表现为前期促进后期（5～12 d）抑制。

关键词：菌核生枝顶孢;诱导抗病性;次生代谢物;保护酶

中图分类号：S643+6;TQ929    文献标识码：A    文章编号：1674-1161（2021）06-0020-04

近年来，生物防治研究越来越受到重视，使得植物内生菌（Endophyte）成为炙手可热的研究对象。枝顶孢属真菌（Acremonium sp.）是已知的具有杀虫抑菌活性的内生菌种属之一，通过激发植物本身的防御体系使其获得局部或系统的抗病能力。为明确枝顶孢菌的诱抗作用，以菌核生枝顶孢（A.sclerotigenum）为靶标，以黑麦草为研究对象，利用比色法测定分析枝顶孢次生代谢物对寄主幼苗保护酶活性的影响，为开发枝顶孢生防制剂和研制植物抗病性诱导剂奠定理论基础和提供应用实例。

1 材料与方法

1.1 供试菌种

靶标菌为菌核生枝顶孢由聊城大学植物病理研究室提供。在无菌条件下将已活化的枝顶孢菌株转接到PDA培养基平板中央，于25±1 ℃下培养至菌丝长满培养皿并产孢。

1.2 次生代谢物提取

将培养好的菌种置于超净台内，用0.7 cm×0.7 cm的打孔器打45个菌饼，接种到装有300 mL不同液体培养基的锥形瓶（经高压灭菌）中，于25+1 ℃的恒温振荡培养箱中培养7 d;经真空抽滤得到的滤液，用旋转蒸发仪（温度60℃）浓缩至15 mL，倒入离心管后加入同体积甲醇溶液，以10 000 r/min在4 ℃下高速离心10 min，取上清液，旋蒸至冷凝管中无溶液滴下，即得次生代谢物。

1.3 供试植物与处理

供试材料为长势一致的黑麦草（Lolium perenne）幼苗，由禾优种业公司生产。

除去籽粒不饱满的种子和杂物后，用清水冲洗种子，移入铺好灭菌纱布的培养皿底中，每皿60粒。用1 200 mg/L的枝顶孢次生代谢物进行处理，时长分别为1/3，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 d。每个处理3皿，以清水作对照，首次处理时每皿15mL，后期处理时每皿10 mL，每天3次， 12 d后將黑麦草整棵取下，用锡箔纸包裹放冰箱冷冻。

1.4 酶活测定

1.4.1 酶粗提液制备 准确称取1 g黑麦草叶片鲜样，放入预冷研钵，加入5 mL 0.2 mol/L的磷酸缓冲液（pH 7.8），冰浴研磨成匀浆，转入离心管，搅动5 min后置于4 ℃下放置2 h，取出后以10 000 r/min在4 ℃下离心20 min，上清液即为酶粗提取液，于4 ℃保存。

1.4.2 蛋白含量及保护酶活性测定 蛋白含量的测定采用考马斯亮兰G-250染色法;酯酶（EST）活性测定按高增贵等方法;超氧化物歧化酶（SOD）活性测定采用NBT光化还原法;多酚氧化酶（PPO）的活性测定按李靖等方法进行。

1.5 数据处理

利用Excel软件进行数据统计整理，经DPSV18.10统计软件进行方差分析等。

2 结果与分析

2.1 代谢物对可溶性蛋白含量的影响

菌核生枝顶孢次生代谢物对黑麦草幼苗可溶性蛋白含量的影响如表1所示。

由表1可以看出：枝顶孢代谢物处理寄主植株黑麦草的时间不同，对其可溶性蛋白含量的影响不同，所有处理的黑麦草可溶性蛋白含量均低于CK（5.94 mg），处理后黑麦草的蛋白含量为2.54～5.40 mg，抑制率为9.05%～57.22%。说明经枝顶孢代谢物处理后，黑麦草蛋白含量下降，即代谢物对黑麦草可溶性蛋白含量呈抑制作用。其中，处理时间为12 d的代谢物抑制作用最强，抑制率为57.22%，其次是3 d（抑制率33.62%）。

2.2 代谢物对苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影响

菌核生枝顶孢次生代谢物对寄主植株黑麦草PAL活性的影响如表2所示。

由表2可以看出：枝顶孢次生代谢物的处理使黑麦草PAL酶活力大小不同（2 330.15～2 337.63 U/g），但均低于CK（2 338.3 U/g），抑制率为0.03%～0.35%。说明经代谢物处理后，黑麦草PAL酶活力下降，即代谢物对黑麦草PAL酶活力表现为抑制作用，且从1 d起，随着处理天数的增加，PAL酶活力呈“V”型曲线变化。其中，PAL酶活力最低的拐点在处理8 d时，为2 330.15 U/g，为CK的99.65%，抑制率为0.35%，表明代谢物在8 d时对PAL酶发挥的抑制作用最大。处理时间为1 d时的黑麦草PAL酶活力最高，为

2 337.63 U/g，是CK的99.97%，抑制率为0.03%。整体来看，处理组PAL酶活力与对照组相比，降低数值较小，但降低趋势明显。

2.3 代谢物对酯酶（EST）活性的影响

菌核生枝顶孢次生代谢物对黑麦草EST活性的影响如表3所示。

由表3可以看出：次生代谢物处理后的黑麦草EST酶活力大小不同，且均高于CK（2 544 U/g），酶活力为2 548～2 584 U/g，促进率为0.14%～1.56%。说明经代谢物处理后，所有天数处理的黑麦草EST酶活力均升高，即代谢物对黑麦草EST的酶活力呈促进作用，并且随着处理天数的增加，EST酶活力呈倒“V”型曲线变化。其中，酶活力最大的拐点在6 d时，为2 584 U/g，是对照的1.02倍，代谢物对黑麦草的促进率为1.56%，表明代谢物在6 d时代谢物发挥的促进作用最大;处理时间为12 d的黑麦草EST酶活力最低，为2 548 U/g，与对照相当，促进率仅为0.14%;其他时间处理中，寄主植株黑麦草的EST酶活力在2 548～2 564 U/g之间，代谢物对黑麦草的促进率为0.15%～0.79%。整体来看，处理组EST酶活力与对照组相比，升高趋势较明显。

2.4 代谢物对超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

菌核生枝顶孢次生代谢物对寄主植株黑麦草SOD活性的影响如表4所示。

由表4可以看出：代谢物处理黑麦草的时间不同，对其SOD酶活力的影响不同，1/3 d时黑麦草SOD酶活力（76.85 U/mg）高于CK（70.64 U/mg），是对照的1.09倍，表现为除促进作用（促进率为11.59%）外，其他所有处理的黑麦草SOD酶活力均低于CK，为28.97～63.55 U/mg，抑制率为7.72%～57.94%，说明经代谢物处理1～12 d，黑麦草体内SOD酶活力均下降，即代谢物对黑麦草SOD酶活力呈抑制作用，并随着处理时间的延长，酶活力呈现出先降低后升高再降低的波动趋势，即抑制率呈现出先升高后降低再升高的趋势。在1～8 d和9～12 d中，SOD酶活力均不断降低，12 d时酶活力最小，为28.97 U/mg，为对照的41.01%，抑制率达57.94%，表明代谢物处理黑麦草12 d时，对SOD酶活力的抑制作用最大;其次是8 d，酶活力为32.62 U/mg，是对照的46.18%，抑制率为52.63%。

2.5 代谢物对多酚氧化酶（PPO）活性的影响

菌核生枝顶孢次生代谢物对寄主植株黑麦草PPO活性的影响如表5所示。

由表5可以看出：次生代谢物在不同天数处理下对黑麦草多酚氧化酶的酶活力大小影响不同，并随着处理时间的延长，酶活力呈现出先升高后降低再升高的趋势，即抑制率呈现出先降低后升高再降低的波动趋势。在1/3～4 d时，次生代谢物对黑麦草的PPO酶活力起促进作用，促进的趋势为先升后降。其中，处理时间为1 d时的PPO酶活力最高，为11 U/g，是对照（10.77 U/g）的1.02倍，代谢物对黑麦草的促进作用最大，促进率为2.16%;其他时间处理中，PPO的酶活力分别为10.94 U/g、10.92 U/g和10.91 U/g，酶活促进1.54%、1.42%和1.29%;在5～12 d时，次生代谢物对黑麦草的PPO 酶活力起抑制作用，抑制趋势为先降后升，处理时间为9 d时的酶活力最低，为10.70 U/g，是对照的99.35%，代谢物对黑麦草的抑制作用最大，抑制率为0.63%;其他时间处理下，PPO的酶活力为10.72～10.76 U/g。整体来看，随着处理天数的增长，次生代谢物对黑麦草PPO酶活力的影响表现为先促进后抑制的变化规律。

3 结论

采用比色（酶活测定）法分析经枝顶孢次生代谢物处理后的黑麦草可溶性蛋白含量、保护酶活性变化，结果表明，代谢物对可溶性蛋白含量和PAL酶、SOD酶活力表现为抑制作用，对EST酶活力表现为促进作用，而对PPO酶活力表现为前期促进后期（5～12 d）抑制。在供试时间内1 200 mg/L菌核生枝顶孢次生代谢物对黑麦草的诱导作用，主要通过PPO和EST两种酶发挥作用，诱导寄主产生抗性以适应外界环境，而SOD和PAL酶对次生代谢物不敏感，发挥作用较小。

黑麦草经枝顶孢次生代谢物处理后，体内保护酶产生相应的变化以适应外界环境，说明其能够通过与植物之间的相互作用，诱导或提高黑麦草寄主抗病和抗逆能力。菌核生枝顶孢是极具希望的生防因子，若能成功研发为植物抗病性诱导剂，将对提高作物的品质与产量有重大意义。

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Effect of Secondary Metabolites of Acremonium Sclerotigenum

on Protective Enzymes Activity in Ryegrass

LIU Xin， SONG Chunyan， MOU Jiaxin， LIU Kaidi， WANG Guiqing*

（College of Agronomy， Liaocheng University， Liaocheng Shandong 252059， China）

Abstract： In order to develop biocontrol agents for Acremonium， with ryegrass as the target plant， the effects of secondary metabolites of Acremonium sclerotigenum on protective enzyme activities of ryegrass were analyzed by colorimetry method. The results showed that the metabolites mainly inhibited the content of soluble protein and the activities of PAL and SOD in ryegrass， but promoted the activities of EST. PPO activity was promoted in the early stage and inhibited in the late stage （5～12 d）.

Key words： Acremonium sclerotigenum; desease induced resistance; secondary metabolite;  protective enzyme

收稿日期：2021-08-08

作者簡介：刘 新（1999—）女，硕士，从事植物栽培与保护方面的研究。

通信作者：王桂清（1968—），女，博士，教授，从事植物保护的教学与科研工作。