橄榄果汁冻干粉的降尿酸与抗痛风作用

张炳森，赵泽安，李咏梅，李 璐，蓝群盛，庞建新，吴 婷

（南方医科大学药学院, 广东广州 510515）

高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）是以血清尿酸的（Uric Acid，UA）水平异常升高为特征，由嘌呤代谢紊乱导致的慢性代谢性疾病[1-2]。机体内的嘌呤化合物及从外界摄取的嘌呤经黄嘌呤氧化酶等酶的作用，最终分解为尿酸[3-4]。尿酸在体内经多种转运蛋白作用完成体内尿酸的转运，如尿酸分泌转运蛋白、尿酸重吸收转运蛋白[5-6]等，最终维持机体尿酸的稳态。机体每天产生的尿酸有70%由肾脏排出，其中主要负责肾脏尿酸重吸收的转运蛋白是位于肾脏顶端的尿酸盐转运体 1（urate transporter 1，URAT1）[7]与位于底端的葡萄糖转运体9（glucose transporter 9，GLUT9）[8-9]，若这些转运体出现异常，引起体内尿酸生成过多和（或）排泄减少，进而导致高尿酸血症。高尿酸是导致痛风最重要的生化基础，当血尿酸浓度超过饱和浓度，尿酸则会以尿酸盐晶体形式析出，可直接沉积于关节及周围软组织、肾脏等，造成组织病理学改变[10]。

目前临床治疗高尿酸血症和痛风的药物疗效有限，且能诱发各种不良反应，如导致过敏性反应[11]、心血管事件[12]、爆发性肝炎[13]等，对机体造成不同程度的损伤。因此，亟需寻找更有效、更安全的食品或者药物来降低高尿酸血症和痛风发生的风险。由于食疗具有安全性高、不良反应少、更受患者喜爱等优点，目前已有研究人员探究了青梅[14]、茶叶[15]、葛根[16]等提取物在改善高尿酸血症和痛风中的作用。此外，人们也通过调整饮食结构，如限制嘌呤摄入、避免饮酒及多食以新鲜蔬菜、水果为主的碱性食品来防治高尿酸血症或痛风[17]。

橄榄果汁冻干粉富含多酚类抗氧化剂，商品名为Hidrox®12%，由美国CREAGRI公司研制，是获得美国FDA安全认证（GRAS认证）的橄榄果食品原料。研究表明，橄榄多酚在心血管健康和其他炎症相关性疾病如关节炎中起着抗炎作用[18-19]，其对高尿酸血症作用的研究也有报道[20]，但主要研究其抑制黄嘌呤氧化酶（XOD）活性方面，目前并无文献报道其降尿酸的其他机制与抗痛风作用。本文研究了橄榄果汁冻干粉对高尿酸血症大鼠的降尿酸作用和缓解痛风性大鼠的关节肿胀作用，并探究其可能的机制，为橄榄果汁冻干粉在食品中的实际应用提供理论与实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF级SD雄性大鼠（体重280±20 g） 南方医科大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK 2016-0041，伦理批准号：L2018050，大鼠放置鼠笼中饲养，温度：23±2 ℃，相对湿度 50%～70%，室内光照时间为12 h日夜循环交替条件下饲养；橄榄果汁冻干粉（Hidrox®12%） 美 国 CREAGRI； 别 嘌 呤 醇（allopurinol，AP）、尿酸（uric acid，UA）、雷西纳德（Lesinurad） 美国Sigma公司；秋水仙碱片（colchicine tablets，Col） 昆明制药厂；氧嗪酸钾（potassium oxazinate，PO）、羟基酪醇、原儿茶酸、香草酸、咖啡酸、香豆酸、胡椒碱、橄榄苦苷、木犀草素 上海阿拉丁生物有限公司；尿酸（UA）、肌酐（creatinine，CR）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）测定试剂盒美国BioAssay Systems公司；黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）测定试剂盒 南京建成生物工程研究所；抗URAT1、GAPDH抗体 爱必信（上海）生物科技有限公司；BCA试剂盒 美国Thermo Fisher公司；HEK-293T细胞、pcDNA3.1（+）-T2AEGFP质粒 本实验保存；培养基、胎牛血清 美国Hyclone公司；Lipofectamine 3000 转染试剂 美国Invitrogen公司；14C-尿酸 美国ARC公司；肿瘤坏死因子α（TNF-α）与白介素 1β（IL-1β）ELISA 测定试剂盒 武汉JYMBIO。

Mill-iQ型纯水系统 美国Millipore；Sigma 3K30高速低温离心机 德国Sigma；Infinite M200型酶标仪 瑞士TECAN；FluorChem R化学发光成像分析系统 美国ProteinSimple；足趾肿胀仪 成都泰盟；Micro Beta2液体闪烁/化学发光检测仪 美国Perkin-Elmer；UPLC-ESI-MS/MS 美国 Thermo Fisher。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠高尿酸血症模型制备与给药 高尿酸血症大鼠模型的制备参考文献中的方法，并做适当调整[21-22]。具体方法：称取适量PO溶于0.5%羧甲基纤维素钠（sodium carboxyl methyl cellulose，CMCNa）并超声30 min使其充分混悬，制成300 mg/kg PO混悬液。40只雄性SD大鼠适应性喂养1周后随机分为正常对照组、模型组、别嘌呤醇组（20 mg/kg）、橄榄果汁冻干粉低剂量组（40 mg/kg）和橄榄果汁冻干粉高剂量组（80 mg/kg），每组8只动物。造模前，给橄榄果汁冻干粉处理组大鼠分别灌胃不同剂量橄榄果汁冻干粉（溶于0.9%生理盐水），每天早上9点灌胃1次，持续7 d。第8 d开始早上8点，除正常组给予CMC-Na，其余各组均腹腔注射PO溶液，持续7 d。造模1 h后除空白组和模型组以等体积溶剂灌胃外，各给药组分别给以相应药物灌胃（整个实验共持续14 d）。第14 d末次给药后1 h，眼眶采血后处死大鼠，血样室温静置40 min后进行离心（3000 ×g，15 min，室温）并分离出血清。肾脏与肝脏组织在冰上快速分离，并保存于-80 ℃，待测。

1.2.2 大鼠痛风性关节炎模型制备与给药 尿酸钠晶体（Monosodium Urate，MSU）的制备参考文献报道的方法[23]。具体方法：将0.5 g氢氧化钠与1 g尿酸加入100 mL双蒸水中，于80 ℃水浴锅中加热20 min，获得澄清溶液，并用稀盐酸调节pH至约7.2，再置于4 ℃过夜冷却，可见大量晶体析出。将获得的晶体溶液进行离心（1500 ×g，5 min，室温），弃去上清，于真空干燥箱中充分干燥获得晶体，分装并称重。使用前用适量磷酸盐缓冲盐溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS）溶液溶解并进行灭菌处理。

40只雄性SD大鼠适应性喂养1周后随机分为正常对照组、模型组、秋水仙碱组（0.3 mg/kg）、橄榄果汁冻干粉低剂量组（40 mg/kg）和橄榄果汁冻干粉高剂量组（80 mg/kg），每组8只动物。造模前，给橄榄果汁冻干粉两组大鼠分别灌胃不同剂量橄榄果汁冻干粉（溶于0.9%生理盐水），持续28 d。从第25 d开始，给秋水仙碱组大鼠灌胃秋水仙碱（用研钵充分研碎后溶于0.9%生理盐水）。第27 d给药后，用6号针在正常组大鼠右脚踝关节腔内注射0.2 mL PBS溶液，其余组均注射0.2 mL MSU溶液（25 mg/mL）。在MSU注射前，后8、12、24 h分别测定各组大鼠关节肿胀程度（评价指标为注射MSU后各时间点的容积减去注射MSU前容积）。末次给药后，进行眼眶取血并处死大鼠。按1.2.1所述处理血清样品。

1.2.3 指标分析 按照说明书方法，用相应的试剂盒分别测定1.2.1中血清的UA、CR和BUN水平，测定血清与肝脏XOD活性，并测定1.2.2所得血清中的TNF-α与IL-1β水平。

1.2.4 Western Blot测定肾脏URAT1蛋白表达水平利用蛋白提取试剂盒提取大鼠肾脏组织总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白含量。取40 μg总蛋白经10% SDS-PAGE凝胶分离；使用湿转法进行转模；将膜在5%的脱脂奶粉溶液封闭2 h；分别加入URAT1一抗（1:1000）、GAPDH一抗（1:1000）后在 4 ℃ 条件下孵育过夜；用TBST洗3次后，对应加入二抗于室温孵育2 h；TBST洗膜后用ECL显色。扫描后使用Image J软件分析条带灰度值[24]。

1.2.5 超高效液相色谱-电喷雾/四极杆串联质谱法（UPLC-ESI-MS/MS）分析橄榄果汁冻干粉成分 本实验中的UPLC-ESI-MS/MS系统由ACQUITY I-Class UPLC和Q Exactive™ Plus MS组成，利用该设备分离并鉴定橄榄果汁冻干粉中的成分。其具体参数为：色谱柱为 ACQUITYUPLC®CSH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相为 0.1% 甲酸水溶液（A）和甲醇（B），梯度洗脱程序为：30 min内B相比例从0%升至100%，30～35 min将B相比例降为0%，并维持5 min，整个运行时间持续40 min。流速为0.5 mL/min，进样体积为5 μL，柱温与进样器温度分别为35与4 ℃。质谱检测器为电喷雾离子源（ESI），负离子模式，离子源温度350 ℃，辅助加热器温度350 ℃；喷射电压3.0 kV，碰撞气：氮气。扫描质量范围 m/z 80～200。

1.2.6 橄榄果汁冻干粉成分对URAT1转运14C-尿酸的活性测定 为检测1.2.5中分离鉴定出的成分的降尿酸活性，通过14C-尿酸吸收实验检测化合物对URAT1转运尿酸的影响，具体方法参考本课题组前期发表文章[13,25]。将HEK-293T细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，并放于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。转染前，将HEK-293T细胞接种到包被了多聚赖氨酸的24孔板，培养24 h后，将pcDNA3.1（+）-EGFP-hURAT1 质粒进行 DNA-脂质体复合物瞬时转染，18 h后分别加入1.2.5分析确定的化合物成分：羟基酪醇、原儿茶酸、香草酸、咖啡酸、香豆酸、胡椒碱、橄榄苦苷和木犀草素八个单体进行14C-尿酸吸收实验。向孔内加入37 ℃预热的尿酸吸收缓冲液500 μL润洗细胞，再加入等量的缓冲液在37 ℃孵育10 min，弃液后加入含25 μmol/L14C-尿酸的尿酸吸收缓冲液，吸收12 min后弃液，再依次加入500、700 μL、1 mL冰冷的DPBS洗三次，弃液后加入0.1 mol/L NaOH裂解液100 μL，室温裂解 20 min，加入 1 mL闪烁液，用振荡仪振荡15 min，使用液体闪烁计数仪测定放射值（CPM），重复测定三次，取平均值。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 橄榄果汁冻干粉对高尿酸血症大鼠血清UA、CR与BUN水平的影响

如表1所示，造模7 d后模型组大鼠血清UA与空白组相比高度显著增加（P＜0.001），表明大鼠高尿酸血症模型造模成功；橄榄果汁冻干粉（80 mg/kg）能极显著降低大鼠血清UA水平（P＜0.01）。

血清CR与BUN是临床评估肾脏损伤的常用指标，肾脏受损会伴随两者水平升高。由表1可得，与空白组相比，造模7 d后模型组大鼠血清CR与BUN水平高度显著和极显著升高（P＜0.001和P＜0.01）；而与模型组相比，橄榄果汁冻干粉给药2周的大鼠两者水平明显降低，表明橄榄果汁冻干粉具有一定的肾脏保护作用；与模型组比较，阳性药AP虽能高度显著降低高尿酸血症大鼠血清UA水平（P＜0.001），但持续使用1周后加重其CR与BUN水平（P＜0.05和P＜0.01），表明持续使用AP可能对肾脏产生损伤，与文献报道相符[26-27]。

表1 橄榄果汁冻干粉对氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症大鼠血清UA、CR与BUN水平的影响Table 1 Effects of olive juice freeze dried powder on the serum UA , CR and BUN levels in PO-induced hyperuricemic rats

2.2 橄榄果汁冻干粉对高尿酸血症大鼠血清与肝脏XOD活性的影响

XOD是体内尿酸生成的关键酶，体内XOD活性受到抑制可减少体内尿酸的生成。如表2所示，与空白组相比，模型组中血清和肝脏XOD活性极显著和高度显著升高（P＜0.01和P＜0.001）；而与模型组比较，阳性药AP与橄榄果汁冻干粉（80 mg/kg）能高度显著降低高尿酸血症大鼠血清与肝脏XOD活性（P＜0.001）。

表2 橄榄果汁冻干粉对高尿酸血症大鼠血清与肝脏XOD活性的影响Table 2 Effects of olive juice freeze dried powder on serum and hepatic XOD activities in PO-induced hyperuricemic rats

2.3 橄榄果汁冻干粉对高尿酸血症大鼠肾脏尿酸重吸收转运体URAT1蛋白表达水平的影响

如图1所示，与空白组相比，模型组肾皮质URAT1蛋白表达水平高度显著增加（P＜0.001）；与模型组相比，橄榄果汁冻干粉（80 mg/kg）则能高度显著下调URAT1蛋白表达水平（P＜0.001），提示橄榄果汁冻干粉可能通过抑制URAT1转运蛋白活性，减少尿酸重吸收，促进尿酸排泄，最终降低其血清UA水平。

图1 橄榄果汁冻干粉对高尿酸血症大鼠肾皮质URAT1蛋白表达水平的影响Fig.1 Effects of olive juice freeze dried powder on the protein expression of URAT1 in the kidney cortex tissues

2.4 橄榄果汁冻干粉对痛风性关节炎大鼠关节肿胀度、血清TNF-α与IL-1β水平的影响

如图2 A所示，与空白组相比，右脚踝关节注射MSU晶体后的8、12和24 h，模型组的关节出现高度显著肿胀（P＜0.001），其中模型组12 h时肿胀度最明显；而与模型组比较，给药组大鼠右脚踝关节的肿胀情况均出现了不同程度的缓解，其中橄榄果汁冻干粉（80 mg/kg）在8 h时便能极显著缓解其肿胀症状（P＜0.01），缓解作用在 24 h 时最强（P＜0.001），且其缓解效果优于阳性药秋水仙碱。

根据文献报道，使用MSU刺激关节会引起各种致炎症因子（如 TNF-α、IL-8 和 IL-1β）的产生，从而引起急性炎症反应[28-29]。目前，痛风的临床治疗主要依赖于降低血尿酸水平和控制炎症反应。由图2B与2C可得，与空白组比较，模型组血清中TNF-α和IL-1β水平极显著升高（P＜0.01）；而与模型组相比，阳性药秋水仙碱和橄榄果汁冻干粉给药组大鼠血清TNF-α和IL-1β水平均出现了不同程度的降低，其中橄榄果汁冻干粉组对降低血清IL-1β水平与秋水仙碱相当，表明其在一定程度能改善MSU诱发的炎症反应。

图2 橄榄果汁冻干粉对MSU诱导的痛风性关节炎大鼠右踝关节肿胀度（A）、血清 TNF-α（B）与 IL-1β（C）水平的影响Fig.2 Effects of olive juice freeze dried powder on paw swelling(A) as well as serum TNF-α(B) and IL-1β (C)levels in MSU-induced rats

2.5 UPLC-ESI-MS/MS检测橄榄果汁冻干粉成分

如图3和表3所示，根据其保留时间、质量数和质量碎片数据及与公开文献的数据进行比对[30-31]，鉴定出8种单体化合物，分别为羟基酪醇（1）、原儿茶酸（2）、香草酸（3）、咖啡酸（4）、香豆酸（5）、胡椒碱（6）、橄榄苦苷（7）和木犀草素（8）。

表3 UPLC-ESI-MS/MS鉴定橄榄果汁冻干粉中的活性化合物Table 3 Mass spectral characteristics and quantification of bioactive compounds detected in olive juice freeze dried powder by using UPLC-ESI-MS/MS

图3 橄榄果汁冻干粉的HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of olive juice freeze dried powder

2.6 橄榄果汁冻干粉对URAT1转运尿酸活性的影响

8 个单体（50 μmol/L）对 URAT1 体外转运尿酸活性如图4所示，其中胡椒碱与木犀草素对URAT1有很强的抑制活性，能明显抑制其转运14C-尿酸，其 IC50值分别为 21.46和 23.42 μmol/L，与 URAT1抑制剂雷西纳德活性相当（16.09 μmol/L）。

图4 胡椒碱与木犀草素对URAT1转运尿酸的影响Fig.4 Effects of piperine and luteolin on uric acid transport by URAT1

3 讨论与结论

尿酸是嘌呤分解的产物，机体内约70%～80%的尿酸由体内嘌呤化合物产生，还有20%～30%来源于饮食等外来因素[23]，因而，饮食控制在高尿酸血症和痛风的长期控制和治疗过程中也占有重要的地位[32]。本研究从天然食品橄榄果汁冻干粉Hidrox®12%中发现其具有降尿酸及抗痛风的作用。

机体尿酸的生成主要依赖于关键酶XOD，抑制XOD的活性可减少UA的生成[33]。本研究发现橄榄果汁冻干粉能够显著抑制血清和肝脏中的XOD活性，发挥降尿酸作用。虽然橄榄果汁冻干粉的降尿酸作用不及AP，但进一步检测发现，与AP组相比，其能够明显降低高尿酸血症大鼠中血清CR和BUN水平，表明其具有肾脏保护作用[34]，能够减少目前临床用药中出现的肾损害等不良反应。

肾脏是尿酸重吸收与分泌的主要调节器官，其依赖于肾脏中多种药物转运体如URAT1的作用[35-36]。大鼠体内研究表明，橄榄果汁冻干粉可下调URAT1蛋白表达水平，抑制尿酸重吸收，促进尿酸盐的排泄，从而降低实验动物的血尿酸水平。体内尿酸水平高于溶解溶度时，会形成的MSU晶体沉积在关节中，诱发细胞炎症因子（如IL-1β和TNF-α）的产生，从而导致急性炎症。因此，抑制炎症反应是治疗痛风的另一个途径[10]。本研究同时发现，橄榄果汁冻干粉可以缓解MSU引起的关节肿胀，同时降低血清中IL-1β和TNF-α的水平，从而改善痛风。

为寻找橄榄果汁冻干粉中能有效作用于URAT1的成分，本研究进一步对其进行活性化合物的分离与鉴定。实验结果表明，它主要包含8种单体，其中胡椒碱与木犀草素在50 μmol/L时能在体外有效抑制URAT1的尿酸转运活性，这也是本研究首次发现两者具有URAT1抑制活性，为橄榄果汁冻干粉的降尿酸作用提供物质基础。

综上，本研究发现橄榄果汁冻干粉具有较好的降尿酸作用，并与抑制XOD活性、减少UA生成、降低肾脏URAT1蛋白表达、促进UA排泄有关。同时，橄榄果汁冻干粉还能明显改善MSU晶体诱导的关节肿胀，降低大鼠体内炎症因子水平来发挥抗痛风的作用。本研究为将橄榄果汁冻干粉开发为新的降尿酸/抗痛风食品或食品添加剂提供了理论依据。