花椒渣超临界CO2萃取物成分及其活性分析

赵慧娟，许腾腾，赵 楠，刘尊英,

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院, 山东青岛 266003；2.利和味道(青岛)食品产业股份有限公司, 山东青岛 266109）

花椒属于芸香科花椒属植物（Zanthoxylum bungeanum），其干燥成熟果皮因具有芳香浓郁、醇麻爽口的特点而被用做香辛料，是人们常用的食品调味料[1]。花椒提取物主要含有挥发油、生物碱、酰胺、香豆素、脂肪酸，还有黄酮类、多酚类等物质[2-4]，具有抗菌、抗炎、镇痛、镇静和抑制血小板凝集作用[5-6]。Pang等[7]研究表明花椒精油可以通过诱导凋亡来抑制黑色素瘤细胞的入侵和增殖，阻断信号通路。因此，花椒提取物在食品抑菌[8]、生物药理等方面具有很大的发展前景。

花椒提取物的制备方法主要有水蒸气蒸馏法、有机溶剂浸提法等，但这些方法存在提取率低、有机溶剂残留等缺点，而超临界CO2萃取技术是一种先进的绿色萃取技术，利用超临界CO2流体的高渗透力和高溶解力萃取分离提取物，提取过程无毒无害、价格低廉易获取，逐渐实现大规模工业化应用[9-11]。Carlotta等[12]运用超临界CO2流体萃取技术，从低价值的杂草和农业废弃物中有效提取了潜在的抗菌化合物和防腐剂成分。

在超临界CO2萃取花椒油的工业化制备过程中，会产生大量的花椒渣料，多被直接丢弃，造成资源浪费。本研究利用超临界CO2流体萃取技术，对花椒渣料进行进一步的萃取，通过色谱串联质谱（LCMS/MS）技术鉴定渣料提取物中的小分子化合物，并研究花椒渣萃取物的抑菌作用与抗氧化作用，以期为花椒渣的高值化利用提高理论依据及基础性研究数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

贡椒 利和味道（青岛）食品产业股份有限公司；甲醇、乙腈、甲酸 色谱纯，Merck KGaA； DPPH、ABTS 索莱宝生物科技有限公司；其他试剂 均为化学分析纯；供试菌株副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、希瓦氏菌（Shewanella）、酵母菌（Saccharomyces） 为实验室保存菌株，经过活化后使用；LB琼脂培养基（胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化钠10 g、琼脂15 g，1 L）、LB肉汤培养基（胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化钠10 g，1 L） 121 ℃灭菌20 min备用。

HA220-50-06超临界CO2萃取装置 南通市华安超临界萃取有限公司；UHPLC超高效液相色谱仪、Q-Exactive HF高分辨质谱 Thermo Fisher Scientific 公司；Zorbax Eclipse C18（1.8 μm×2.1×100 mm）色谱柱 Agilent technologies公司；多功能酶标仪Molecular Devices公司。

1.2 实验方法

1.2.1 四种花椒萃取物的制备 花椒萃取物的制备：以贡椒为原料，经粗略粉碎后，进行超临界CO2萃取，萃取条件为压力25 MPa，温度40 ℃，时间5 h，萃取完成后分离得到花椒油树脂。

花椒渣萃取物的制备：以花椒萃取物剩余渣料为原料，以95%乙醇为夹带剂，经单因素实验得到较优提取条件为：夹带剂流量20 mL/min，温度45 ℃，压力25 MPa，时间5 h，经减压分离得到花椒渣萃取物。

精油和麻素分离物的制备：将花椒油树脂再次超临界萃取进行二次精制分离，改变萃取温度和压力分离得到花椒精油分离物，在萃取釜中回收得到花椒麻素分离物。

上述萃取物及分离物用无水乙醇溶解稀释至400 mg/mL，4 ℃保存备用。

1.2.2 色谱与质谱条件 色谱条件：C18色谱柱（Zorbax Eclipse C18（1.8 μm×2.1×100 mm））；流动相 A为0.1%甲酸溶液（含10 mmol/L甲酸铵）；B为纯乙腈；洗脱梯度（0～2 min，B 5%；2～7 min，B 30%；7～14 min，B 78%；14～20 min，B 95%；20～25 min，B 5%）；柱温为 30 ℃；流速 0.3 mL/min；进样量为 2 μL，自动进样器温度4 ℃[13]。

质谱条件：正离子模式：加热器温度325 ℃；鞘气流速：45 arb；辅助气流速：15 arb；吹扫气流速：1 arb；电喷雾电压：3.5 kV；毛细管温度：330 ℃；SLens RF Level：55%。

扫描模式：一级全扫描（Full Scan，m/z 100～1500）与数据依赖性二级质谱扫描（dd-MS2，TopN=10）；分辨率：120000（一级质谱） & 60000（二级质谱）。碰撞模式：高能量碰撞解离（HCD）[13]。

定性、定量：使用Compound Discoverer 3.1对质谱峰进行分析矫正处理，根据二级质谱信息利用Thermo mzCloud在线数据库，Thermo mzValut本地数据库等，进行物质鉴定。

1.2.3 抑菌效力测定 抑菌效力测定采用滤纸片扩散法，参考文献[5,14]稍作修改，将直径6 mm的圆滤纸片灭菌后浸泡在各样品中12 h，然后贴在涂布有菌液的LB固体培养基上，溶剂浸泡滤纸片作为对照；将平板置于28 ℃培养箱中倒置培养12 h，观察各菌的生长情况并记录数据，重复三次。

1.2.4 最小抑菌浓度测定 最小抑菌浓度（MIC）测定采用二倍试管稀释法，参考文献[5,15]稍作修改，取9支试管编号1～9，在1～7号试管中样品终浓度为 50、25、12.5、6.25、3.125、1.5、0.7 mg/mL；在1～8号试管中加入菌液50 μL，9号试管为培养基空白对照；各管终体积2 mL，将各试管于28 ℃振荡培养箱中培养12 h，观察细菌生长情况确定最小抑菌浓度MIC，并将无细菌生长的试管取50 μL倒板，观察有无菌体生长。每个样品重复三次。

1.2.5 DPPH自由基清除率测定 DPPH自由基清除率测定参考文献[16-17]的方法进行，测定前用无水乙醇将样品稀释成系列梯度：150、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5 mg/mL。用无水乙醇溶解二苯代苦味酰基（DPPH），终浓度为0.1 mmol/L，避光储存备用。取1.5 mL DPPH溶液，与50 μL待测样品液混匀，在48孔板中室温避光反应30 min，在517 nm波长处测定吸光值，记为A1；将1.5 mL无水乙醇和50 μL样品混匀测定值记为A2，1.5 mL DPPH与50 μL无水乙醇混匀测定值记为A0。重复三次实验。自由基清除率计算公式如下：

1.2.6 ABTS+自由基清除率测定 参考文献[17-18]等方法进行测定，测定前用无水乙醇将样品稀释成系列梯度：150、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5 mg/mL。ABTS储备液配置：用纯净水配制含7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L K2S2O8溶液的储备液，暗室避光放置12～16 h。ABTS应用液：将储备液用无水乙醇稀释，使其在734 nm处吸光值为0.7±0.02（大约 40～50 倍）。取 1.5 mL ABTS 溶液，与 50 μL待测样品液混匀，在48孔板中室温避光反应6 min，在734 nm波长处测定吸光值，记为A1；将1.5 mL无水乙醇和50 μL样品混匀测定值记为A2，1.5 mL ABTS与50 μL无水乙醇混匀测定值记为A0。重复三次实验。自由基清除率计算公式同式（1）。

1.3 数据处理

数据处理采用SPSS 22.0软件（Statistical Product and Service Solutions，SPSS），数据作图采用Origin软件。每组实验重复三次，结果以平均值±标准差表示。处理间差异采用邓肯氏多重比较，显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 花椒渣萃取物LC-MS/MS分析

经LC-MS/MS检测，花椒提取物中共检出68种化合物，其中花椒渣萃取物共有50种，检出化合物占萃取物的91.32%，LC-MS/MS离子谱图如图1～图4所示。从表1可以看出，不同的分离提取条件，化合物成分不同，花椒渣萃取物和花椒萃取物以及花椒麻素的成分含量相近，但与花椒精油的差异较大，可能因为花椒精油中多为挥发性成分。花椒提取物的主要成分有生物碱、烯醇、香豆素、多酚，还含有类固醇、酰胺、黄酮等物质，与其他研究[5,10,19]结果一致。在花椒渣萃取物、花椒萃取物、麻素分离物中，石斛碱、胺环戊酯和喷布特罗三种物质相对含量达60%以上，其中石斛碱的含量最高，分别占38.28%、35.79%、37.19%。石斛碱是一种吡咯里西啶衍生物类生物碱，研究表明石斛碱具有较好的药用功效，在抗炎症、心血管保护、神经系统和糖脂代谢调控[20]等方面效果显著[21]。在精油分离物中，石斛碱、姜黄烯和吐纳麝香的相对含量较高，占比38.7%。另外有研究表明黄酮类、生物碱、氨基酸、酚酸等物质多是导致花椒苦味特征的化合物[22]。

表1 四种花椒提取物的成分组成Table 1 Components of of the four Zanthoxylum bungeanum extracts

图1 花椒渣萃取物LC-MS/MS离子图谱Fig.1 LC-MS/MS ion-chromatogram of Zanthoxylum bungeanum residue extract

图2 花椒萃取物LC-MS/MS离子图谱Fig.2 LC-MS/MS ion-chromatogram of Zanthoxylum bungeanum extract

图3 麻素分离物LC-MS/MS离子图谱Fig.3 LC-MS/MS ion-chromatogram of zanthoxylin

图4 精油分离物LC-MS/MS离子图谱Fig.4 LC-MS/MS ion-chromatogram of Zanthoxylum bungeanum essential oil

续表1

从LC-MS/MS分析结果可以看出花椒渣萃取物中的活性成分及其含量与花椒萃取物相似，某些成分含量甚至更高，因此花椒渣具有较高的利用价值，可以在提供活性成分的同时实现花椒废弃渣料的高值化利用。

2.2 花椒渣萃取物的抑菌活性

2.2.1 花椒渣萃取物抑菌效力定性分析 从表2可以看出，花椒渣萃取物对8种试验菌均具有一定的抑制作用，其中对副溶血弧菌和希瓦氏菌的抑制作用较强，对大肠杆菌的抑制作用较弱。花椒渣萃取物表现出的抑菌活性可能与萃取物中的多酚、黄酮类、生物碱等含量密切相关[23]。此外，花椒萃取物、麻素分离物和精油分离物对试验菌株也表现出一定的抑菌作用，表明花椒提取物具有广谱的抑菌性，与Yu等研究结果一致[24]。四种组分中，花椒精油表现出了较强的抑菌作用，伍燕等[17]的研究表明，花椒精油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母具有较好的抑制性，其中对大肠杆菌的抑制效果相对较弱。花椒渣萃取物、花椒萃取物和麻素分离物虽然成分相近，但其具体含量存在差异，并且不同的试验菌对各物质也表现出不同的敏感性，因此表现出不同的抑菌效力。

表2 四种花椒提取物的抑菌效力Table 2 Antibacterial efficacy of four kinds of Zanthoxylum bungeanum extracts

2.2.2 花椒渣萃取物对各供试菌株的最小抑菌浓度最小抑菌浓度结果表明，不同提取物对不同菌种的MIC存在较大差异（表3），花椒渣萃取物对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌和希瓦氏菌的抑制作用最强，其MIC均为3.125 mg/mL，其次为金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌，其MIC分别为6.25和12.5 mg/mL，对大肠杆菌的抑制作用最弱，其MIC为25 mg/mL，结果与抑菌效力实验一致。其他提取物中，精油分离物的抑菌性较强，对副溶血弧菌、希瓦氏菌以及酿酒酵母的MIC为均为0.7 mg/mL，花椒萃取物与麻素分离物抑菌作用较弱。

表3 四种花椒提取物的最小抑菌浓度MICTable 3 MIC of four kinds of Zanthoxylum bungeanum extracts

2.3 花椒渣萃取物的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除率 提取物的DPPH自由基清除率如图5所示，花椒渣萃取物的清除率最高，在50 mg/mL时清除率达到91.35%，而花椒萃取物和麻素分离物只有38.27%和59.42%，清除率呈浓度依赖性，存在显著性差异（P＜0.05）。精油分离物的清除率最低，在150 mg/mL的浓度下，清除率只有12.4%，可能与提取成分的化合物种类和相对含量有关。由此可见，DPPH自由基清除能力大小：花椒渣萃取物＞麻素分离物＞花椒萃取物＞精油分离物。

图5 四种花椒提取物的DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH free radical scavenging rates of four Zanthoxylum bungeanum extracts

2.3.2 ABTS+自由基清除率 提取物的ABTS+自由基清除率如图6所示，各萃取物的自由基清除能力呈浓度依赖性，其中花椒渣提取物的清除率最高，在12.5 mg/mL时清除率达到100%，麻素分离物在50 mg/mL时达到99.48%，花椒提取物在100 mg/mL时达到99.33%，精油分离物的清除率最低，在150 mg/mL的浓度下，清除率只有46.89%，根据前文成分分析结果可知，抗氧化能力的差异可能与主要成分及其含量相关，各提取物之间存在差异显著性（P＜0.05）。由此可见，ABTS+自由基清除能力大小：花椒渣萃取物＞麻素分离物＞花椒萃取物＞精油分离物。

图6 四种花椒提取物的ABTS+自由基清除率Fig.6 ABTS+ free radical scavenging rates of four Zanthoxylum bungeanum extracts

3 结论与讨论

本研究联合超临界CO2流体及95%乙醇夹带剂制备了花椒渣萃取物，通过LC-MS/MS成分分析鉴定了花椒渣萃取物中共有50种化合物，主要包括生物碱、烯醇、香豆素、黄酮类、酰胺类等物质，并且主要成分石斛碱的相对含量达到了38.28%，有研究表明石斛碱具有较好的药用价值[25]。柴丽琴等[19]采用GC-MS对花椒油树脂进行分析，其结果主要是烯醇类、酯类、萜类、花椒素等化合物，与本研究结果一致，但其主成分物质为花椒素，含量达到10.85%，这与花椒的产地、品种、工艺条件、测定方法等因素有关。花椒渣萃取物的物质成分和相对含量与花椒萃取物、麻素分离物相似，但与精油分离物差异较大，因为膏状萃取物多是不具有挥发性的成分，而精油分离物多是挥发性成分。花椒渣萃取物具有较强的抑菌作用，对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌和希瓦氏菌的抑制作用最强，其MIC均为3.125 mg/mL，其次为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌，对大肠杆菌的抑制作用最弱。花椒渣萃取物具有一定的抗氧化作用，12.5和50 mg/mL的花椒渣萃取物对ABTS自由基和DPPH自由基的清除率分别为100%和91.35%。研究表明不同的提取方式和萃取溶剂所得到的花椒油树脂的抑菌活性和抗氧化活性具有较大的差异[26]。

本文研究表明了花椒渣萃取物包含多种活性组分，具有一定的抑菌作用和抗氧化作用，在食品、医药、饲料等领域具有广阔的应用开发空间，能够实现花椒渣料资源的高值化利用。但是本文仅对花椒渣萃取物的抑菌活性和抗氧化活性做了简单探究，对其抑菌机理缺乏更加深入的探索。另外，对花椒渣料进行超临界CO2萃取，成本较高，对其提取和利用方式还需进一步优化。