魏光强,赵 娜,范尧珠,王雪峰,黄艾祥,田 洋
(云南农业大学食品科学技术学院, 云南昆明 650201)
辣木(Moringa oleifera)是多年生热带落叶乔木,目前广泛种植于我国的云南、广东、广西、福建、台湾等地区,资源量丰富[1]。辣木的叶子、种子、根和花皆可食用,辣木籽富含蛋白质(质量分数29.4%~38.3%)[2],其中 Val、Leu、Ile、His等多种氨基酸的含量接近或远高于联合国粮食及农业组织/世界卫生组织标准模式谱,可作为优质蛋白质资源加以开发利用[3-5]。
糖尿病患者近年来呈上升趋势,糖尿病已成为继癌症和心血管疾病之后威胁人类健康的第三大杀手[6]。降血糖肽一般是指可用于治疗II型糖尿病的一类活性肽[7]。相较于其他天然产物类降糖功能因子,降糖肽结构清楚,作用机制明确;活性更高、用药剂量更小、毒副作用更低[8];与蛋白质相比,几乎没有免疫原性,而且可以通过化学方法合成;具有较稳定的胃肠消化特性。目前开发出的植物源降糖肽包括苦瓜降糖肽[9]、发酵大豆降糖肽[10]、灵芝降糖肽[11]、黑豆降糖肽[12]等。酶法提取降糖肽具有提取率高、反应条件温和的特点,更适合将来的工业化生产[13],如王晟等[14]利用木瓜蛋白酶水解山杏仁蛋白制备降血糖粗肽。辣木籽富含蛋白质,经酶解处理后能产生具有多种生物学功能的活性肽,包括抗氧化肽、抗菌肽等[15-16]。然而,有关辣木籽降糖肽的研究却鲜有报道。
本实验采用酶法制备辣木籽蛋白水解物,以水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率为指标,通过单因素筛选和响应面优化辣木籽降糖肽的最佳酶解工艺,采用超滤法截留不同分子量范围的酶解物并进行降糖活性分析,并通过细胞实验研究其对HepG2细胞的抑制作用,以期为辣木籽降糖肽以及功能性食品的开发提供理论与方法指导。
辣木籽产自云南省德宏州,云南天佑科技开发有限公司提供;MTT、木瓜蛋白酶(80万U/g)北京索莱宝科技有限公司;三氯乙酸(TCA)天津市风船化学试剂科技有限公司;PNPG(分析纯)上海宝曼生物科技有限公司;α-葡萄糖苷酶(200 U/mL)腾达生物试剂耗材有限公司;DMEM培养基美国GIBCO公司。
AD300L-H高速均质分散机上海轩澄仪器有限公司;SCIENTZ-18N真空冷冻干燥机上海比朗仪器制造有限公司;Merck Millipore(膜片直径76 mm)超滤杯上海轩仪仪器设备有效公司;UV-1800CP紫外分光光度计上海美谱达仪器有限公司;Multiskan Go酶联免疫检测仪赛默飞世尔科技公司;HFsafe-1200LC生物安全柜上海力申科学仪器有限公司;BPN-80CW二氧化碳培养箱上海一恒科学仪器有限公司。
1.2.1 辣木籽蛋白的制备 参照王雪峰等[16]方法略作修改制备辣木籽蛋白。采用盐提法将脱脂辣木籽粉用0.3 mol/L NaCl溶解,料液比1:10(w/v)。待完全溶解后用0.1 mol/L NaOH调节溶液pH至7.15,然后置于30 ℃水浴中搅拌30 min。溶解液抽滤去渣,收集滤液(抽滤液用75%乙醇清洗)。下层滤液于室温下经4000 r/min离心30 min,收集上清液,然后再次抽滤去渣,收集下层滤液,于旋转蒸发仪中45 ℃旋蒸45 min,最后收集浓缩液真空冷冻干燥制得冻干粉,置于-80 ℃冰箱保存,备用。测得辣木籽水溶性蛋白的纯度为50.96%。
1.2.2 辣木籽降糖肽的酶法制备 称取1 g辣木籽蛋白冻干粉,按液料比为40:1加入纯水,匀浆5 min(3000 r/min),加入木瓜蛋白酶 0.55 g,于 55 ℃ 条件下酶解4.5 h,酶解结束后于95 ℃,10 min灭酶,冷却,离心沉淀(4000 r/min,30 min),收集上清液得到辣木籽多肽酶解液,采用邻苯二甲醛(OPA)法测定蛋白水解度。
1.2.3 酶解工艺优化
1.2.3.1 单因素实验 以酶解温度为55 ℃,酶解时间为 4.5 h,酶添加量为 5.5%,液料比 40:1,酶解pH7为基本条件,在其他条件不变的前提下,设置酶的添加量为2.5%、3.5%、4.5%、5.5%、6.5%;液料比为 10:1、20:1、30:1、40:1、50:1;酶解时间为 2.5、3.5、4.5、5.5、6.5 h;酶解温度为25、35、45、55、65 ℃;pH为 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,以酶解产物的蛋白水解度和α-葡萄糖苷酶抑制率作为衡量指标进行单因素实验。
1.2.3.2 响应面试验设计 在单因素实验的基础上,采用中心组合设计对酶解工艺进行优化。选取A酶解时间(h)、B料液比、C初始pH 3个关键影响因素进行响应面分析,因素水平编码表见表1。
表1 响应面分析因素及水平表Table 1 Factors and level of response surface analysis
1.2.4 蛋白质水解度测定 采用邻苯二甲醛(OPA)法[17]测定蛋白质水解度。在避光条件下向装有3 mL OPA试剂(200 mg SDS,7.62 g四硼酸钠,160 mg OPA,4 mL乙醇和176 mg DTT用去离子水溶解,定容至200 mL,避光保存)的试管中分别加入400 μL浓度为0.5 mg/mL的丝氨酸标准溶液、去离子水(空白溶液)和辣木籽蛋白酶解液(样品溶液),混匀5 s后,室温反应2 min,于340 nm处测定吸光度。蛋白质水解度按如下公式计算:
式中:DH为蛋白质水解度,%;h为被水解的肽键数,meqv/g;htot为蛋白质总肽键数,8.2 meqv/g。
OPA法测定蛋白质水解度的计算公式为:
1.2.5α-葡萄糖苷酶抑制率的测定 参照Lim等[18]的方法略作修改,测定辣木籽酶解液的α-葡萄糖苷酶抑制率。吸取5 μL的25 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液,10 μL 的样品溶液和 620 μL pH6.8 的 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液于试管中,混匀后于37.5 ℃下反应20 min,然后加入 10 μL 10 mmol/L PNPG 溶液,混合并在37.5 ℃下反应30 min,最后,通过添加650 μL浓度为0.2 mol/L的碳酸钠溶液终止反应。使用分光光度计测定每个样品在405 nm处的最大吸光度,每个样品重复测定6次。α-葡萄糖苷酶抑制率的计算公式如下:
式中:A样品为实验组,多肽+酶+PNPG+Na2CO3;A样品对照为样品对照组,多肽+PBS+PBS+Na2CO3;A对照为样品对照组,PBS+酶+PNPG+Na2CO3。
1.2.6 辣木籽降糖肽的超滤分离 在最佳酶解工艺条件下酶解辣木籽制备辣木籽酶解液,过10、5、3 kDa三种不同截留分子量的超滤膜进行超滤粗分离,得到分子量为10、10~5、5~3、<3 kDa 4 个组分的辣木籽酶解液,冷冻干燥制得冻干粉,置于-80 ℃冰箱保存,备用。
1.2.7α-葡萄糖苷酶抑制率IC50值测定 将辣木籽酶解液各超滤组分冻干粉配制成浓度为2、4、6、8、10 mg/mL的样品(浓度梯度≥5),分别测定其α-葡萄糖苷酶抑制率,以浓度为横坐标,抑制率为纵坐标,进行非线性拟合,得出回归方程,并计算α-葡萄糖苷酶抑制率的IC50值。
1.2.8 辣木籽降糖肽组分对人肝癌细胞的抑制作用参考姚兴梅等[19]的方法略作修改进行辣木籽降糖肽组分对人肝癌细胞的抑制作用测定。将对数生长期的HepG2细胞倾去培养液,用3 mLPBS清洗一次,再用1 mL胰蛋白酶-EDTA消化3 min,使细胞变为球形,加入3 mL 10%牛血清DMEM培养液终止消化反应。1500 r/min离心3 min,去除上清液,调整细胞液密度约为4×104cells/mL(台盼蓝染色后计数),200 μL/孔接于 96孔板中。待 12 h细胞贴壁后,弃去原培养液,分别加入100 μL浓度为200、300、400 μg/mL的含降糖肽DEME培养基处理24、48、72 h,每个浓度设置3个复孔。以不加降糖肽的组作为空白组,只加DMSO溶液的作为试剂对照组。培养 24、48、72 h之后加入 20 μL 5 mg/mL的 MTT溶液,于培养箱培养4 h后弃尽孔内液体,最后加入150 μL的DMSO溶液。酶标仪490 nm(震板10 min)进行检测。细胞存活率按以下公式计算:
本次试验中α-葡萄糖苷酶抑制率数据均重复6次,结果表示均以实验数据的平均值±标准偏差的形式呈现。采用Box-Behnken 8.0.6、SPSS 19.0进行数据处理;采用Origin 2018进行图表绘制。
2.1.1 酶添加量对辣木籽蛋白酶解产物水解度及α-葡萄糖苷酶抑制率的影响 酶用量作为酶解反应的基本条件,对蛋白水解活性具有重要的影响。酶添加量对酶解产物水解度及抑制率的影响如图1。当酶的添加量较低时,酶与底物作用小,蛋白质不能被完全水解;而当酶添加量过高时,底物完全被反应后则会达到饱和,即使继续添加酶,水解度变化不大。从图1中可以看出随着酶添加量的增加,水解度先急剧上升后平缓上升,主要原因是底物添加量固定不变,当酶的添加量到达一定量时,水解度不再上升,趋于平缓。而从最初2.5%的添加量开始,α-葡萄糖苷酶的抑制率一直呈现上升的趋势,当酶添加量为5.5%时抑制率到达了最高点,酶添加量高于5.5%时α-葡萄糖苷酶抑制率缓慢下降,原因可能是一定的酶添加量有利于α-葡萄糖苷酶抑制肽的生成,而过高的加酶量会使水解产生的多肽继续水解,将已经水解得到的降糖肽水解成为降糖活性低或者没有活性的肽片段,从而导致酶解液的α-葡萄糖苷酶抑制率降低[20]。综合考虑,酶的最佳添加量为5.5%。
图1 酶添加量对酶解产物水解度及抑制率的影响Fig.1 Effect of enzyme addition on the degree of hydrolysis and inhibition rate of enzymatic hydrolysis products
2.1.2 液料比对辣木籽蛋白酶解产物水解度及α-葡萄糖苷酶抑制率的影响 液料比对酶解产物α-葡萄糖苷酶的抑制率和水解度的影响如图2。根据图2可以看出,当液料比为40:1时,抑制活性和水解度已达到了最高点,当该比例大于40:1时,α-葡萄糖苷酶的抑制率和水解度呈下降的趋势。这可能是因为植物蛋白中含有植物蛋白酶抑制剂,能与蛋白酶作用与底物共享蛋白酶的结合基团,表现出竞争性抑制作用[21],表明最佳料液比应为40:1。
图2 料液比对酶解产物抑制活性及水解度的影响Fig.2 Effect of material-liquid ratio on inhibition activity and degree of hydrolysis of enzymatic hydrolysis products
2.1.3 酶解时间对酶解产物抑制活性及水解度的影响 酶解时间是酶解反应的一个重要因素,如若时间太短,反应不充分,酶解效果不理想;而时间太长,酶易失活,水解效果不佳,所以合适的酶解时间对整个反应过程起着关键的作用。酶解时间对酶解产物活性及水解度的影响如图3。从图3中可以看出,酶解液的蛋白水解度随着酶解时间的延长逐渐提升,α-葡萄糖苷酶抑制活性在4.5 h达到峰值,抑制率在4.5 h后下降,原因是在4.5 h的酶水解之后,活性肽链被过度酶降解,结构被破坏,并且酶产物的抑制活性大大降低[22]。所以综合考虑,酶水解时间应控制在4.5 h。
图3 酶解时间对酶解产物活性及水解度的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on the activity and degree of hydrolysis of enzymatic hydrolysis products
2.1.4 温度对酶水解产物的活性和水解度的影响温度对水解效果有着显著的影响,当酶解温度过高时会导致蛋白构象发生改变或破坏,影响酶的活性和酶解反应的进行[23]。温度对酶水解产物α-葡萄糖苷酶抑制率和水解度的影响见图4,由图4可知,随着温度的升高,α-葡萄糖苷酶的抑制率和水解度的值都不断的上升,当温度到达55 ℃时,α-葡萄糖苷酶的抑制率和水解度均达到最高值,而当温度高于55 ℃后,则出现了下降的现象,因为每种酶都有最佳的反应温度,当温度超过了它原本所能承受的温度时,酶的活性反而会受到抑制而降低,影响了酶促水解的速率。因此,最佳酶水解温度应选择在约55 ℃。王晟等[14]研究发现木瓜蛋白酶制备山杏源降糖肽的最佳酶解温度为50 ℃,与本研究相近。
图4 温度对酶水解产物的活性和水解度的影响Fig.4 Effect of temperature on the activity and degree of hydrolysis of enzyme hydrolysates
2.1.5 pH对酶水解产物活性和水解度的影响 pH会影响蛋白质和蛋白酶的结构空间,使蛋白质发生变化和蛋白酶失去活性,从而对水解产生影响[24]。pH对酶水解产物的活性和水解度的影响见图5,从图5中可以看出,当pH为8时,酶水解产物对α-葡糖苷酶的抑制活性和水解度是最好的;而当pH小于8或者大于8时,α-葡萄糖苷酶的抑制率和水解度会受到酸碱条件的影响,不论是偏酸还是偏碱都会影响酶的活性和底物结构。综合评定,最佳反应pH应为8。
图5 pH对酶水解产物活性和水解度的影响Fig.5 Effect of pH on the activity and degree of hydrolysis ofenzyme hydrolysate
2.2.1 响应面试验设计及结果 根据单因素实验的结果,采用Box-Behnken Design中心组合设计原理,以酶解温度、液料比、酶解pH为考察因素,α-葡萄糖苷酶抑制率(Y)为响应值,建立数学模型,以获得其最佳酶解工艺条件。
Box-Behnken Design设计方案及响应值结果和Box-Behnken Design实验方差分析如表2、表3所示。二次方程模型为:
表2 响应面试验结果Table 2 Experimental results of response surface test
表3 响应面回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface regression model
Y=-331.11875+28.85875A+4.70937B+46.56125C-0.15225AB-0.75000AC-0.077750BC-1.78250A2-0.041500B2-2.41750C2
根据表3所示可知该模型P<0.01,说明木瓜蛋白酶酶解辣木籽蛋白制备降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率的回归方程模型极显著,同时失拟差P=0.9485>0.05并不显著,通过观察失拟差的显著性更加说明了该模型具有合理性。因此,可以使用该模型来分析和预测整体实验结果。由表4中A、B、C的F值大小可以推断出,3个因素对酶水解产物抑制活性的影响顺序为C>B>A,其中C和B的影响对于酶解pH和酶水解产物更为重要。酶解pH和液料比对酶解产物速率抑制活性具有更大的作用;所有平方项影响均极显著(P<0.01),B2和 C2的作用更为重要;并且相互作用影响相对平方项较小,其中AB极显著(P<0.01),AC、BC 显著(P<0.05)。三个因素之间两两交互作用下的三维图和等高线图如图6~图11所示。
图11 液料比与酶解pH交互作用的等高线图Fig.11 Contour plot of interaction between material-liquid ratio and enzymatic hydrolysis pH
表4 验证实验结果Table 4 Verification experiment results
图6 酶解时间与液料比交互作用的三维图Fig.6 Three-dimensional diagram of the interaction between enzymatic hydrolysis time and material-liquid ratio
图7 酶解时间与料液比交互作用的等高线图Fig.7 Contour plot of the interaction between enzymolysis time and material-liquid ratio
图8 酶解时间与酶解pH交互作用的三维图Fig.8 Three-dimensional diagram of the interaction between enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis pH
图9 酶解时间与酶解pH交互作用的等高线图Fig.9 Contour diagram of interaction between enzymatic hydrolysis time and enzymatic hydrolysis pH
图10 料液比与酶解pH交互作用的三维图Fig.10 Three-dimensional diagram of the interaction between material-liquid ratio and enzymatic hydrolysis pH
使用Design-Expert 8.0.6软件分析回归方程,确定最优工艺条件分别为酶解时间4.63 h,液料比40.51:1和初始pH为8.26。在此工艺下酶解产物的抑制活性预测值为23.6%。考虑到实验条件和其他问题的可行性,改良的酶解工艺条件如下:酶解时间4.6 h,液料比40.5:1,pH为8.3,在此条件下,重复三组实验,得到的辣木子蛋白酶解液对α-葡萄糖苷酶的抑制活性为23.62%±0.14%,接近预测值25.38%,蛋白质的水解度为16.44%±0.02%,且三组实验稳定性较好。
图12为辣木籽降糖肽各超滤组分对α-葡萄糖苷酶的抑制率的IC50值,各超滤组分均表现出一定的α-葡萄糖苷酶的抑制活性,其中分子量<3 kDa的辣木籽降糖肽对α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高,其抑制率IC50值为5.56 mg/mL,说明辣木籽降糖肽截留分子量越小,抑制活性越高,与文献报道的其他功能性多肽制备的结果[21-22,25]相似。刘丽君[26]研究表明分子量<3 kDa的驼血酶解物超滤组分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性最高,与本研究结果一致。
图12 不同截留分子量的辣木籽降糖肽对α-葡萄糖苷酶的抑制活性Fig.12 Inhibitory activity of Moringa seed glycopeptides with different molecular weight on α-glucosidase
分子量<3 kDa的辣木籽降糖肽组分对人肝癌细胞的抑制作用如图13所示。当辣木籽降糖肽质量浓度为300 μg/mL时,作用于 HepG2细胞48 h后显著抑制了HepG2细胞的增殖(P<0.05),细胞存活率均低于90%,且随着时间的延长抑制效果愈加明显;当质量浓度为400 μg/mL,作用时间为72 h时,抑制HepG2细胞的增殖愈加显著(P<0.01),此时细胞的存活率为86.4%。张晶等[27]、王立峰等[28]研究表明了菜籽抗氧化肽及膜分离各组分在质量浓度为400 mg/L时也可显著抑制HepG2细胞的增殖,而这些植物蛋白源活性肽可能会通过影响DNA的复制和有丝分裂、线粒体膜电位和钙离子浓度的平衡状态进而抑制细胞增殖[29]。综上所述,<3 kDa的辣木籽降糖肽组分对人肝癌细胞具有一定的抑制作用,但具体的抑制机理有待进一步研究。
图13 分子量<3 kDa的辣木籽多肽对人肝癌细胞的抑制作用Fig.13 Inhibitory effect of Moringa oleifera seed peptides with molecular weight <3 kDa on human liver cancer cells
本实验采用单因素实验及响应面分析法优化了辣木籽降糖肽的酶解制备工艺,获得其最佳酶解条件为酶解时间4.6 h、液料比40.5:1、pH为8.3、酶添加量5.5%、温度为55 ℃,该条件下酶解物的α-葡萄糖苷酶抑制率为23.62%±0.14%,水解度为16.44%±0.02%。利用超滤法对酶解液进行组分分离,其中分子量<3 kDa的超滤组分降糖活性最好,当其质量浓度为300 μg/mL时,能显著抑制HepG2细胞的增殖(P<0.05)。因此,从辣木籽蛋白中水解得到的小肽可作为用于控制糖尿病的保健食品中潜在的活性成分,研究可为后续辣木籽降糖肽的分离鉴定奠定基础,为辣木籽功能性食品的开发提供重要参考。