251 份欧洲冬小麦成株期抗条锈病鉴定及抗条锈病基因检测

翟雪婷，赵池铭，汪军成，姚立蓉，司二静，王化俊，孟亚雄，岳维云，尚勋武，李葆春

（1.甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃省作物遗传改良与种质创新实验室，甘肃兰州 730070；2.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070；3.定西市临洮农业学校，甘肃定西 730500；4.甘肃农业大学农学院，甘肃兰州 730070；5.天水市农业科学研究所，甘肃天水 741000）

由条型柄锈菌（Puccinia striiformis f.sp.tritici）引起的小麦条锈病是世界范围内最重要的小麦病害之一。它可通过高空气流长距离传播，具有发生面积大、发病时难以控制等特点[1]，在高湿和阴冷环境条件下极易暴发。小麦感染条锈病菌后，其植物发育和籽粒灌浆都会受到严重影响，导致产量下降和品质受损，造成重大经济损失。病害流行年份可致小麦减产高达70%，严重时甚至绝收。一般情况下，小麦品种在生产上使用3～5 a 便“丧失”其抗条锈病性，其中，条锈菌的不断变异和抗源品种的单一化种植是引起我国小麦品种抗条锈病性丧失的主要原因[2-3]。目前，小麦抗病育种面临的主要问题是抗源匮乏、抗性遗传基础狭窄[4-5]。要解决上述问题，只有寻找新的抗源和抗性基因，拓宽抗性基础，增加其遗传多样性。所以，引进和合理利用国外品种不失为解决抗性资源不断狭窄的一种有效方法。

杜久元等[6]对2 900 份国外小麦种质资源进行了抗条绣病性鉴定，筛选出条锈病免疫材料18 份，高抗条锈病且优质的材料9 份，CMT.Du 2、CMT.Du 4、CMT.Du 5、CMT.Du 6、CMT.Du 7、CMT.Du 8、CMT.Du 9等7 个持久抗条锈材料的抗性表现稳定；韩德俊等[7]利用已知抗条锈基因的分子标记对1 980 份小麦地方品种和国外种质进行了抗条锈性鉴定与评价，建立了小麦条锈病抗源鉴定和评价体系，筛选出50 余份具有不同抗病性特征的抗源材料；白玉路等[8]利用与Yr10、Yr15、Yr18 和Yr39 紧密连锁的分子标记对美国西北部59 个小麦品种（系）进行了分子检测，结果表明，Yr18、Yr39 在美国西北部小麦品种（系）中的分布较普遍，并且大部分可抵抗我国当前流行的条锈菌生理小种。以上研究在小麦抗源的筛选、鉴定等相关工作中起着重要的参考意义。

董玉琛等[9]对欧洲18 个国家的358 个冬、春小麦品种的农艺性状进行了鉴定与评价，简述了各国品种的特点，全部品种的生育期、株高、主穗粒数和千粒质量等性状变异丰富，向育种家推荐了一批优良种质，并提供了部分品种的系谱；王兰芬等[10]对该批材料与东亚小麦品种进行了遗传多样性的比较分析，共检测到865 个等位变异，欧洲和东亚品种分别检测到730、716 个等位变异，特有等位变异分别为150、135 个。近1/2 基因座的等位变异频率及其分布在欧洲与东亚材料间存在明显差异。但目前尚未见该批欧洲小麦材料在我国抗条锈病基因鉴定中的相关研究报道。

本研究对251 份欧洲冬小麦材料进行了田间成株期抗条锈病鉴定，并利用分子标记检测了已知抗病基因（Yr10、Yr15、Yr18 和Yr26）在供试材料中的存在与否，旨在明确供试材料的抗性水平和抗病基因类型，综合评价该批种质材料的利用价值，旨在为进一步培育抗条锈病新品种及抗病新基因的鉴定奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

251 份供试欧州冬小麦材料及感病对照品种铭贤169 由甘肃农业大学干旱生境作物学重点实验室、天水市农业科学研究所提供。已知基因载体品系Avocet S*6/Yr10、Avocet S*6/Yr15、Avocet S*6/Yr18、Avocet S*6/Yr26 由甘肃省农业科学院植物保护研究所、西北农林科技大学植保学院提供。251 份冬小麦材料来源及育成年份参见文献[9-10]。

1.2 试验方法

1.2.1 田间成株期抗条锈病鉴定 在甘肃省天水市中梁实验站田间进行2 a 条锈病自然诱发试验。将供试251 份小麦材料进行条播，每份材料种植2 行，每隔20 行种植2 行铭贤169，作为感病对照材料。成株期当感病品种充分发病后，对田间材料进行病情调查。按照国家农业行业标准（NY/T 1443.1—2007）进行小麦抗条锈病鉴定，其反应型分为6 级标准，即0 级（免疫）、0；级（近免疫）、1 级（高抗）、2 级（中抗）、3 级（中感）、4 级（高感）；严重度按9 级标准划分，即0、1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%、100%。共调查2 次，并以2 次调查结果高的为准。

1.2.2 251 份小麦材料DNA 的提取及分子检测采用改良CTAB 法[11]对251 份供试小麦以及4 个基因载体品系幼叶进行DNA 提取，选用已开发的Yr10、Yr15、Yr18 和Yr26 共4 个抗条锈基因的连锁标记（表1）分别对供试材料进行分子检测，所用引物由擎科生物技术有限公司合成，PCR 反应体系为25 μL，包含2×PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性40 s，50～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35～40 个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。产物进行2%和3%琼脂糖凝胶电泳，观察条带特征并统计供试品种抗病基因的特征带出现情况。

表1 小麦抗条锈病基因的分子标记

2 结果与分析

2.1 田间成株期抗病鉴定

供试251 份小麦材料成株期抗条锈病鉴定结果如表2 所示，141 份材料表现为成株期抗条锈病，占供试材料的56.18%。其中，表现为免疫、近免疫、高抗和中抗的材料分别有45、0、72、24 份，分别占供试材料的17.93%、0、28.69%和9.56%；表现中感和高感的材料有110 份，占供试材料的43.82%（图1）。

表2 小麦成株期抗条锈病鉴定及分子检测结果

续表2

续表2

续表2

续表2

2.2 抗条锈病基因检测

2.2.1 Yr10 分子检测 利用SINGH 等[12]开发的SCAR 标记Yr10F/R 来检测Yr10（图2），阳性条带为543 bp，小麦材料中扩增出146 条与对照品种相同的条带，推测有146 份材料可能含Yr10，占总数的58.17%。这些检测到可能含有Yr10 的材料在欧洲18 个国家均有分布（表2）。

2.2.2 Yr15 分子检测 利用KLYMIUK 等[13]开发的特异性引物Yr15K1 来检测Yr15（图3），阳性条带为992 bp，小麦材料中扩增出28 条与对照品种相同的条带，推测有28 份材料可能含有Yr15，占总数的11.16%，分别为奥地利、比利时等14 个国家的材料。南斯拉夫、法国、芬兰、西班牙4 个国家的材料没有检测到。

2.2.3 Yr18 分子检测 利用STS 标记csLV34[14]检测Yr18，阳性条带为150 bp（图4），小麦材料中扩增出27 条与对照品种相同的条带，推测有27 份材料可能含有Yr18，占总数的10.76%，分别为比利时、保加利亚等9 个国家的材料，奥地利、西班牙等9 个国家的材料未检测到。

2.2.4 Yr26 分子检测 利用WANG 等[15]根据ESTSSR 开发的大小为451 bp 的STS 标记WE173 检测Yr26，未检测到供试品种（系）含有这个基因的特征性条带。

2.3 Yr 基因组合分子检测

在本试验所筛查的小麦材料中（表2），F43、F53 等33 份材料同时检测到2 种抗条锈病基因，包含3种组合方式（Yr10 ＋Yr15、Yr10 ＋Yr18、Yr15＋Yr18），其中，F43 等16 份材料检测到Yr10 与Yr15；F48 等14 份材料检测到Yr10 与Yr18；F244检测到Yr15 与Yr18；3 份材料同时检测到3 种抗条锈病基因，包含Yr10＋Yr15＋Yr18，分别为F235、F334 和F348 等3 个品种。可能携带Yr10、Y15、Yr18的材料分别有146、28、27 份，分别占供试小麦的58.17%、11.16%、10.76%。在供试小麦材料中未检测到与Yr26 基因相同条带，推测可能不含Yr26 基因。F4、F5 等89 份材料未检测到携带已知抗条锈病基因，其中，41 份田间鉴定表现为抗条锈病，推测可能含有其他已知或者未知抗病基因。

3 讨论

长期大面积种植含有单一抗条锈病基因的小麦品种，为新的条锈病流行小种大肆传播创造了条件，导致许多抗病基因抗性降低甚至“丧失”[16]。因此，为解决小麦品种抗病性减弱、抗源单一的问题，对国内外种质进行抗条锈病性鉴定，可为我国抗条锈病小麦育种挖掘出新的抗病基因，丰富抗源材料[8，17]。本研究通过对251 份欧洲小麦材料进行2 a田间成株期抗条锈病鉴定，筛选出141 份成株期抗病材料，其中免疫45 份、高抗72 份、中抗24 份；所有的法国材料田间均表现为抗条锈病。董玉琛等[9]对这批欧洲小麦品种的农艺性状鉴定与评价中，向育种家推荐了一批优良种质，其中就包括本研究中的4 份法国材料，这4 份田间农艺性状优良且抗条锈病的材料可以作为重点材料加以改造利用。

Yr10 和Yr15 均为小种专化型全生育期抗性基因且抗病水平很高[18]。庄巧生[18]研究认为，在中国小麦育种史上没有使用Yr10 和Yr15 的证据；尉法刚等[19]在对400 份我国育成的小麦品种（系）条锈病成株期抗性鉴定与评价中检测到可能携带Yr10，有10 份材料，占比很低，仅为4.75%。而在本研究对251 份欧洲小麦材料的检测中，检测到Yr10 的品种为146 份，出现的频率高达58.17%，其中，抗病材料为88 份，占比为60.27%，感病材料为58 份，占比39.73%。分析在可能检测到Yr10 的材料中仍有部分材料表现感病的原因可能是某种表达抑制现象或基因重组导致基因未表达，或者是成株期鉴定有误以及分子检测假阳性现象的发生，建议今后可充分利用这些表现抗病且检测到抗病基因的国外材料用于国内的抗病育种中。尉法刚等[19]对400 份小麦品种（系）条锈病成株期抗性鉴定与评价中检测到可能携带Yr15 的材料有19 份，仅占4.75%；白玉路等[8]在美国西北部59 个小麦品种（系）中仅检测到12 个小麦材料可能携带Yr15，占21.43%；徐默然等[20]在103 份小麦品种（系）抗条锈性和遗传多样性评价及基因检测中未检测到Yr15。而在本研究中，对供试小麦检测可能含有Yr15 基因的材料也仅有28 份，占比为11.16%，与前人对中国材料和美国西北部材料的研究结果一致，Yr15 基因的应用比例表现很低，但28 份材料中有19 份材料田间表现抗病，占比67.86%，大部分表现抗病，今后可将这些材料酌情应用于抗病育种中。

Yr18/Lr34/Pm38 是一个慢锈抗性基因位点，对小麦叶锈、白粉也具有部分抗性[21]。本研究中检测到可能含有Yr18 的小麦27 份，占比10.76%，占比较小，与杨文雄等[22]对我国小麦育成品中慢锈基因Lr34/Yr18 的分子检测中得出“231 份育成品种（系）中携带Lr34/Yr18 基因的材料仅占6.1%”的研究结果基本一致。曾庆东等[23]在持久抗病基因Yr18 在我国小麦抗条锈育种中的应用中得出，495 份小麦材料中Yr18 基因仅占2.02%，研究结果也基本一致；但与白玉路等[8]在对美国西北部59 个小麦的研究中的结果产生差异，其原因可能是材料来源地不同。说明此基因不仅在我国小麦中比例较少，在欧洲小麦材料中比例也较少，应当在我国的小麦抗病育种中加以重视和利用。

4 结论

经田间成株期鉴定，251 份小麦材料中，表现抗病的材料有141 份，其中，表现为免疫、高抗和中抗的材料分别有45、72、24 份，分别占供试材料的17.93%、28.69%和9.56%；表现中感和高感的材料有110 份，占43.82%。分子检测结果表明，携带Yr10、Yr15、Yr18 基因的品种分别有146、28、27 份，分别占供试小麦的58.17%、11.16%、10.76%，Yr26 分子标记在试验材料中未检测到。33 份材料同时携带2 种抗锈基因，包含3 种组合方式（Yr10＋Yr15、Yr10＋Yr18、Yr15＋Yr18），3 份材料同时携带3 种抗锈基因，组合方式为Yr10＋Yr15＋Yr18，89 份材料未检测到携带上述已知抗锈基因，其中41 份田间鉴定表现为抗条锈病，推测可能含有其他已知或者未知抗病基因。本研究为筛选优良的抗条锈病材料提供了参考依据。