基于间断化学分析仪的茶多酚测定方法研究

刘华丰

（福建省产品质量检验研究院，福建 福州 350002）

茶多酚是茶叶主要的保健功效成分之一[1,2]，属于多酚类物质，不同茶叶中茶多酚总量差别较大[3]，一般来说，普洱熟茶含量最低，一般在6%～12%之间，绿茶含量最高，干物质占比可达到30%～36%以上。

目前，国标检测茶多酚的方法主要是福林酚分光光度法，涉及的标准包括GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》[4]和GB/T 31740.2—2015《茶制品 第2部分：茶多酚》[5]附录A方法。福林酚法准确度高、稳定性好、适用范围广，但检测比较费时费力。

1 材料与方法

1.1 原理

茶叶经磨碎过筛后，用70%甲醇提取，经稀释后在碱性条件下与福林酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐反应，产生深蓝色钼蓝和钨蓝的混合物。在一定的吸收波长下，蓝色深度与茶多酚含量成正比，用没食子酸作校正曲线，定量茶叶中的茶多酚含量。

1.2 仪器

间断化学分析仪：CleverChem380（德国DeChem-Tech.GmbH，精度：0.0001 Abs）；

电子分析天平：d=0.0001 g，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；

精密水浴锅：0～14500 r/min；

紫外可见光光度计：UV-2700，日本岛津公司（KYOTO），185～900 nm（精度：0.1 nm）

1.3 试剂

70% （体积分数）甲醇水溶液、碳酸钠溶液（7.5%）、福林酚溶液（10%，体积分数）。

1.4 方法

1.4.1 样品前处理

各向同性材料：本身具有各向同性属性的原料，多种物料均匀混合，各微小颗粒体虽然具有各向异性属性，但由于大量微小颗粒的随机分布，可以将其均匀混合物近似视为各向同性材料。配合饲料虽然由玉米等大量各向异性原料微粒混合而成，但由于大量微粒的随机分布和排列，可将模孔中的物料颗粒近似视为各项同性材料(武凯等，2013)。各向同性材料其实是横观各向同性材料的特殊情况。

称取0.2 g（精确到0.0001 g）经均匀磨碎后的试样，放入10 mL离心管中，用70 ℃甲醇水溶液（70%）浸提10 min，每隔5 min涡旋一次，冷却后以4000 r/min离心5 min，取出上清液，残渣依上步骤再浸提一次，合并上清液，用甲醇水溶液定容至10.0 mL，用0.45 μm有机膜过滤。取滤液1.00 mL，用三级水定容至100 mL，待测。

1.4.2 标准工作也的配制

称取0.110 g 没食子酸（GA，相对分子量188.14），溶解并定容至100 mL，得1.00 mg/mL标准储备液，再取5.00 mL储备溶液，稀释定容至100 mL，得50.0μg/mL标准工作液.

1.4.3 茶多酚含量测定

取没食子酸工作溶液（分别按1∶20、1∶10、1∶5、1∶4、1∶2、1∶1稀释）、水、测试液于反应皿中，加入福林酚试剂（以下简称R1），静置T1，加入7.5%碳酸钠（以下简称R2），静置T2，测定吸光度A。

式中：A——测试液吸光度；A0——空白液吸光度；V0——提取液定容体积（mL）。

1.5 参数的选择

1.5 1 滤光片波长的确定

用移液管移取3.00 mL没食子酸标液储备液，用水定容至100 mL容量瓶中，此工作液浓度为30μg/mL。取该工作液1.00 mL于25 mL比色管中，加入5.0 mL福林酚试剂，摇匀，静置反应4 min，加入4.0 mL碳酸钠溶液（浓度7.5%），加水定容至10.0 mL，室温静置60 min，用10 mm比色皿在波长浓长500～800 nm之间扫描，将得到波长与吸光值的关系（图1）。

图1 波长对30 μg/mL标准曲线吸光值的影响

由图1可看出，在500～800 nm范围内对标液显色后进行扫描，随着波长的增加，吸光值逐渐升高，在700～770 nm时，吸光值升高不明显，形成一个高位平台，当波长大于770 nm后，吸光值随波长的增加而逐渐降低。结合间断化学分析仪（CleverChem380，德国）中提供的波长滤光片510、520、550、630、660、700 nm的实际情况，确定700 nm为最佳波长。

1.5.2 样品体积的确定

分别移取标准工作溶液50、100、150、200 μL，按1.4.3操作，选择波长700 nm，试剂R1（福林酚试剂）450 μL试剂R2（碳酸钠溶液）350μL，反应间隔时间为加入R1静置120 s，加入R2静置600 s，将得到不同体积工作溶液与吸光值关系（图2）。

由图2可看出，加入不同的标准工作溶液体积，按要求稀释后显色，吸光度与标准工作溶液体积并不完全成比例，150 μL线曲间距大效果好，故选择150 μL样液进行实验。

图2 样液稀释比例对吸光值影响

1.6 仪器参数的设置

滤光片：700 nm；样液及试剂加入量：样液150 μL；试剂R1（福林酚试剂）450 μL；试剂R2（碳酸钠溶液）350 μL；反应时间：试剂R1和样液混匀T1（120 s）后加试剂R2，再反应T2（600 s）后自动读取吸光值。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线及回归方程

吸光度（A）与标准溶液浓度对应数值见表1，标准曲线见图3。

表1 标准曲线

图3 间断化学分析仪测定没食子酸工作曲线

2.2 加标回收率试验

以正山小种为样品本底，添加3个加标浓度，分6次按1.6参数要求测定，本底茶多酚含量为11.96%，计算回收率，结果如表2。从表2可以看出，没食子酸的回收率在96.4%～104.0%。

表2 加标回收（n=6）

2.3 方法精密度

选取有代表性的茶叶样品，运用间断化学分析仪测定茶多酚（n=6），结果如表3所示， 按最严格要求RSD全部小于1.3%，符合GB/T 27417—2008《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》[6]中对方法精密度的要求，表明方法的精密度良好。

表3 方法精密度（n=6）

2.4 准确度试验

采用间断化学分析仪与国标方法GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》进行横向方法比对，以验证其方法的准确性。结果如表4所示，同一样品两种方法测定值相对误差0.07%～1.24%，相对误差小于国标方法允差要求（≤5%），P＞0.05，两种方法测出数据无显著差异，方法结果具有一致性，证明准确性良好。

表4 间断化学分析仪法与国标方法数据比对（n=3）

3 讨论

综上试验结果，在以下参数条件下：波长700 nm，样品量150 μL，试剂R1（福林酚试剂）450μL，试剂R2（碳酸钠溶液）350 μL，试剂R1和样液混匀间隔120 s， R2反应间隔600 s，应用间断化学分析仪对典型茶叶样品进行自动测定，在标液浓度0～50 mg/L范围线性良好，R2=0.999，相对标准偏差RSD小于1.3%。应用化学间断化学分析仪对8种典型样品（绿茶、红茶、白茶、铁观音、茉莉花茶、肉桂、砖茶、普洱茶）进行检测，与国标方法GB/T 8313—2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》对比，两种方法测定相对误差0.35%～1.24%，相对误差小于在国标方法允差，两种方法测定结果一致性好，而间断化学分析仪法更具有操作简单、方便快速、节省人力的优点。

4 结论

本试验研究了使用间断化学分析仪，在设定的参数条件下，测定茶叶中茶多酚含量。得出结论：在波长700 nm，样品量150μL，试剂R1（福林酚试剂）450 μL，试剂R2（碳酸钠溶液）350 μL，试剂R1和样液混匀间隔120 s， R2反应间隔600 s条件下，检测结果与国标方法结果准确度、精密度一致。