徐小龙 ,刘 颖 ,陈乃江
(1. 南京中医药大学连云港附属医院·江苏省连云港市中医院,江苏 连云港 222006; 2. 江苏省连云港市食品药品检验检测中心,江苏 连云港 222006)
葛根定眩胶囊由葛根、桂枝、生白芍、炙甘草、僵蚕、羌活、川芎、钩藤、生姜9 味中药组方,其主要功效为解肌和营、疏风定眩,主治太阳经枢不利所致颈项强痛、头痛、头晕目眩等症状。该制剂中含有僵蚕,2020 年版《中国药典(一部)》中收载的相关药材均涉及黄曲霉毒素(AF)的检测。AF 属呋喃香豆素的多环结构化合物,主要由黄曲霉和寄生曲霉次级代谢产生[1-2],AFB1,AFB2,AFG1,AFG2,AFM1,AFM2是 AF 最常见的有毒衍生物,其中毒性最强的是 AFB1[3]。目前,检测 AF 的方法有液相色谱 - 质谱联用法[4-6]、荧光分光光度法、高效液相色谱法、免疫层析法、酶联免疫吸附法、高效液相色谱(HPLC)- 柱后光化学衍生法等[7-15]。其中 HPLC - 柱后光化学衍生法简便快捷,且AFB1和AFG1经紫外线照射即具有荧光性[7],应用HPLC 荧光检测器就可完成检测。本研究中建立了测定葛根定眩胶囊中AF 有毒衍生物 AFB1,AFB2,AFG1,AFG2含量的 HPLC - 柱后光化学衍生法,并评价其安全性,为提高其质量标准提供参考。现报道如下。
Waters 2695 型高效液相色谱仪(美国Waters 公司),配有 Waters 2695-2475 型荧光检测器,Empower 3 型色谱工作站;KQ-500TDB 型数控超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司,功率为500 W,频率为80 kHz);AE-100 型电子天平(瑞士Mettler Toledo 公司,精度为0.000 1 g);AF 免疫亲和柱(青岛普瑞邦生物工程有限公司,批号为171117)。
葛根定眩胶囊(江苏省连云港市中医院院内制剂,批号分别为 20201208,20210618,20210619,20210620);AFB1,AFB2,AFG1,AFG2混合对照品溶液(中国食品药品检定研究院,批号为610001-202006,标示浓度依次为 1.04,0.38,1.08,0.38 μg /mL);甲醇、乙腈(色谱纯,德国默克公司);磷酸、氯化钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);水为娃哈哈纯净水。
色谱柱:Phenomenex C18Gemini 柱(250 mm ×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇 - 乙腈 - 水(40 ∶18 ∶42,V / V / V);流速:1.0 mL /min;柱温:25 ℃;检测器:荧光检测器;激发波长:365 nm;发射波长:450 nm;进样量:10 μL。在此色谱条件下,相邻色谱峰的分离度大于1.5,阴性对照无干扰。色谱图见图1。
图1 系统适用性试验高效液相色谱图1.AFG2 2.AFG1 3.AFB2 4.AFB1A.Mixed standard solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms of the system suitability test
精密量取 AFB1,AFB2,AFG1,AFG2混合对照品溶液0.5 mL,置10 mL 容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,作为混合标准品贮备液。精密量取混合标准品贮备液1 mL,置25 mL 容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即得AF 混合标准品溶液。取样品,倾出内容物,研细,取15 g,精密称定,置匀质瓶中,加氯化钠3 g,精密加入70%甲醇溶液75 mL,高速搅拌 2 min,离心(转速为 12 000 r/min)5 min,精密量取上清液15 mL,置50 mL 容量瓶中,加水稀释并定容,摇匀,离心(12 000 r/min)10 min,取上清液 20 mL,过AF 免疫亲合柱,加水20 mL 洗脱,弃洗脱液,使空气入柱,将水挤出,加适量甲醇洗脱,收集洗脱液,置2 mL容量瓶中,加甲醇稀释并定容,摇匀,0.45 μm 微孔滤膜滤过,取续滤液,即得供试品溶液。以甲醇为阴性对照溶液。
线性关系考察、检测限及定量限确定:精密吸取2.2 项下 AF 混合标准品溶液 5,10,15,20,25 μL,按2.1 项下色谱条件进样测定,记录峰面积。以进样量(X,pg)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归,结果见表1。精密量取2.2 项下AF 混合标准品贮备液,以甲醇逐级稀释,按2.1 项下色谱条件进样测定,以信噪比(S / N)为 3 时的响应强度浓度为检测限,以 S / N 为10 时的响应强度浓度为定量限。结果见表1。
精密度试验:取2.2 项下混合标准品溶液适量,按2.1 项下色谱条件连续进样测定7 次,记录峰面积。结果见表1,表明仪器精密度良好。
重复性试验:取同一批(批号为20210619)样品2 g,精密称定,共6 份,精密量取2.2 项下混合标准品溶液0.4 mL,依法制备供试品溶液,按 2.1 项下色谱条件进样测定2 次,记录峰面积。结果见表1,表明方法重复性良好。
稳定性试验:取2.2 项下供试品溶液适量,分别于室温下放置 0,1,2,4,8,12 h 时进样测定,并记录峰面积。结果见表1,表明供试品溶液在12 h 内稳定。
表1 方法学考察结果Tab.1 Results of the methodological investigation
加样回收试验:取不含AF 的阴性样品,倾出内容物,研细,取15 g,精密称定,置匀质瓶中,加氯化钠3 g,精密加入70%甲醇75 mL,搅拌2 min,离心(转速为12 000 r/min)5 min,精密量取上清液 15 mL,置 50 mL容量瓶中,分别精密加入混合标准品溶液1,2,3 mL,按2.2 项下方法制备供试品溶液,按2.1 项下色谱条件进样测定,并计算含量。结果见表2。
表2 加样回收试验结果(n =9)Tab.2 Results of the recovery test(n = 9)
取样品(批号分别为 20201208,20210618,20200619,20210620)适量,按2.2 项下方法制备供试品溶液,按2.1 项下色谱条件进样测定,记录峰面积,并计算含量,结果见表 3。2020 年版《中国药典(一部)》规定,AFB1和AFB1,AFB2,AFG1,AFG2总量的最高限量分别为 5 μg/kg和10 μg/kg,故4 批样品AF 残留量测定结果均符合药典规定。
表3 样品含量测定结果(μg/kg)Tab.3 Results of content determination of AF in the samples(μg /kg)
中药材和食品中AF 检测方法主要有薄层层析法、液相色谱法、酶联免疫吸附法、金标免疫层析检测技术、质谱法等。葛根定眩胶囊由9 味药材组方,成分复杂,其中僵蚕属昆虫类药物,生物活性蛋白成分多,用常规的薄层层析法及酶联免疫吸附法做定性检测,专属性不强。HPLC-柱后光化学衍生法可定量快速检测;另外,商品化的免疫亲合柱多,获取方便,方法简单,易验证和确认,用于检测葛根定眩胶囊中AF 有毒衍生物的含量,灵敏度高,特异性强,快捷准确。
AF 为极性化合物,流动相以水为基础溶剂。曾考察乙腈 - 水(55 ∶45,V / V)和甲醇 - 水(70 ∶30,V / V)2 种流动相对色谱分离效果的影响,均能有效洗脱和检测AF,但以甲醇 - 乙腈 - 水(40 ∶18 ∶42,V / V / V)为流动相时AFB1,AFB2,AFG1,AFG24 个成分均能做到基线分离,色谱峰峰形尖锐、对称。以流动相为背景溶液,以荧光检测器在190 ~600 nm 波长范围内测定混合标准品溶液,结果AFB1,AFB2,AFG1,AFG2最佳激发波长为 360 nm,AFG1和AFG2在 450 nm 波长附近有最大吸收,AFB1和 AFB2在430 nm 波长附近有最大吸收,最终选择激发波长为360nm,发射波长为 450nm。AFB2和 AFG2荧光吸收较弱,借助紫外衍生器(254 nm)荧光吸收强度可提升10 倍以上。
AF 性质相对稳定,标准品溶液和供试品溶液在2.1 项下色谱条件的响应稳定可靠,且考虑样品前处理净化、富集是影响测定结果的主要因素,必要时可进行加样回收试验。对于多数阴性样品或远低于限度的极弱阳性样品,不必追究其真实含量和检测精密度;对于远超限度的强阳性样品,可采用外标一点法予以定量控制。
AF 是一种剧毒物质,已被癌症研究机构划为一类致癌物,适宜生长和产毒的条件为10 ~45 ℃,最适温度为30 ℃,相对湿度为85%,要求药品在存储、运输过程中要注意控制温度和相对湿度。需进行AF 检测的中药材品种包括15 个种子果实类中药材(马钱子、使君子、大枣、豆蔻等),2 个根和根茎类中药材(远志、延胡索),8 个动物类中药材(水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣、僵蚕、蜂房、九香虫、土鳖虫)[16]。本研究中仅 1 个批次样品检出AF 有毒衍生物,其含量为 AFB11.39 μg / kg,AFB20.13 μg /kg,AFG20.10 μg /kg,其他 3 个批次均未检出。2020 年版《中国药典(一部)》规定,AFB1的最大限量为 5 μg / kg,AFB1,AFB2,AFG1,AFG2总量不超过10 μg/kg,符合药典规定,可为以僵蚕生药粉为原料的中成药检查AF 提供参考。
本研究中建立的方法简便快捷,结果准确可靠,专属性强,灵敏度高,可用于葛根定眩胶囊的质量控制,且所检测的AF 残留量均符合药典标准。