核桃炭疽病发生相关的酚类物质代谢分析*

陈 新 王 敏 傅茂润 王贵芳 相 昆 刘庆忠 焦文晓 张美勇 许海峰

(1. 山东省果树研究所/国家果树种质核桃板栗资源圃 泰安 271000； 2. 费县绿缘核桃专业合作社 临沂 273400；3. 齐鲁工业大学食品科学与工程学院 济南 250353)

核桃(Juglansregia)因其营养价值和保健功能，被认为是“21 世纪的超级食品”(李敏等， 2009； Maetal.， 2010)。我国核桃属种质资源丰富，种植范围广泛(马庆国等， 2019)，但其病害也愈加严重，其中炭疽病是核桃生产中的灾难性病害，严重制约核桃产业发展(Zhuetal.， 2014)。炭疽病主要在6—7月开始发病，8—9月份最为严重，症状一般为青皮炭疽病斑近圆形、黑褐色，中央病区凹陷产生黑色小点(曲文文等， 2011)。大部分学者认为核桃炭疽病主要由胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起(Wangetal.， 2020)，但也有学者在核桃中分离出暹罗炭疽菌(C.siamense)、果生刺盘胞菌(C.fructicola)和尖孢炭疽菌(C.acutatum)等(Wangetal.， 2017； Wangetal.， 2018； Lioetal.， 2018)。

植物酚类物质是重要的次生代谢物，能够抑制细菌、真菌等病原体的侵染(Oliveiraetal.， 2008； Limaetal.， 2019)。植物受炭疽菌侵染能够触发诱导抗性，产生各种酶、单宁、黄酮等物质抵抗病原菌危害(汪爱娥， 2005)。Dicko等(2005)发现酚类物质能够抑制炭疽菌的生长，此外，多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和过氧化物酶(peroxidase，POD)能够氧化酚类物质，促进木质素及缩合单宁等物质的合成，抑制病原菌生长与扩散(杨光道， 2009)，这表明酚类物质在抵抗病原菌方面发挥重要作用。目前，核桃炭疽病防治主要以苯并咪唑类杀菌剂等化学药剂为主(刘霞等， 2013)，长期单一使用此类药剂，不仅导致抗药性产生，还对环境造成危害。

核桃青皮中含有大量酚类物质(陆俊等， 2014)，但在生产中多作为废弃物扔掉，关于核桃青皮炭疽病相关酚类物质分析及有效成分鉴定方面未见报道。代谢组学可寻找生物标记物、药物靶点、研究病害机制。本研究以核桃‘香玲’和‘泰勒’为试材，对其青皮体外接种胶孢炭疽菌，通过靶向代谢组学分析侵染后核桃青皮中酚类物质含量及相关变化，筛选抗炭疽病有效成分，为探究炭疽病发生机制和后期开发炭疽病相关天然药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2020年9月下旬于山东省果树研究所金牛山基地采摘‘香玲’和‘泰勒’2个核桃品种。胶孢炭疽菌菌株由山东省果树研究所植保研究室范昆提供。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化 接种环刮取适量胶孢炭疽菌菌丝，于15 mL离心管中(含适量无菌水及灭菌玻璃珠)，用涡旋振荡器震荡10 s，过滤制得1×106个·mL-1孢子悬浮液。

1.2.2 核桃胶孢炭疽菌接种 选取大小均匀、成熟度一致(八成熟)、无机械损伤、无病虫害的核桃果实，用75%的酒精擦拭果实表面，除去果实表面病原菌，用灭菌的钢钉在每个核桃赤道部位均匀刺3个伤口(长×宽×高=2 mm×1 mm×2 mm)，用移液枪吸取15 μL 1×106个·mL-1胶孢炭疽菌孢子悬浮液滴入伤口，待伤口处菌悬液被吸收后，将核桃果实移入塑料筐(长320 mm、宽240 mm、高100 mm)内，用0.03 mm厚的聚乙烯保鲜袋封口，放置室温(温度25 ℃、湿度90%)培养、观察，用C.g表示接种胶孢炭疽菌孢子悬浮液核桃果实，CK表示不加菌悬液的核桃果实，3次生物学重复。然后将胶孢炭疽菌侵染后的核桃青皮送欧易生物科技有限公司进行130种酚类物质(标准品购自源叶生物和Sigma-Aldrich公司)利用超高效液相色谱-串联质谱(Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS)分析。

1.2.3 UPLC-MS/MS分析 1)经冷冻离心干燥机(Scientz-10N)冻干后样品约50 mg，加入600 μL提取液[水∶甲醇(V∶V=1∶2，含琥珀酸-2,2,3,3-d4和Lyso PC17∶0, 50 ng·mL-1)],再加入400 μL氯仿。2)加入2颗钢珠，研磨机(JXFSTPRP-24/32)60 Hz研磨2 min。3)冰水浴超声提取20 min，离心10 min(4 ℃，13 000 r·min-1)，取上清500 μL装入EP管中。4)向残渣中继续加入400 μL，涡旋1 min，超声提取20 min。5)离心10 min(4 ℃，13 000 r·min-1)，取300 μL上清，跟之前的500 μL上清合并，共计800 μL。6)取200 μL上清挥干，然后用200 μL水∶甲醇(V∶V=18∶7，含内标L-2-氯苯丙氨酸，10 ng·mL-1)复溶，涡旋30 s，超声2 min。7)离心5 min(4 ℃，13 000 r·min-1)，用注射器吸取200 μL的上清液，使用0.22 μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到棕色LC进样小瓶，-80 ℃下保存，直到进行UPLC-MS/MS分析。质控样本(QC)由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个QC体积与样本相同。

1.3 数据处理与分析

使用 The Human Metabolome Database(HMDB)和Lipidmaps(v2.3)以及 METLIN 数据库对原始数据进行定性分析，利用三重四级杆质谱的多反应检测(MRM)模式获得质谱分析数据，对色谱峰进行峰面积积分，将代谢物的积分峰面积带入标准曲线线性方程进行计算，最终得到实际样本中的绝对含量数据。利用 Excel 2010 对数据进行后期编辑(作图，标准差分析)，用 DPS 7.05软件(http： ∥www.chinadps.net)进行显著性检验(P< 0.05)。

2 结果与分析

2.1 ‘香玲’和‘泰勒’体外胶孢炭疽菌侵染分析

由图1可知，在0～6天，未接种胶孢炭疽菌的‘香玲’青皮无明显变化，而接种胶孢炭疽菌的‘香玲’青皮病斑在第6天明显变大； ‘泰勒’青皮未接种和接种胶孢炭疽菌后，接种部位在0～6天均无明显变化，表明‘泰勒’青皮具有更高的炭疽病抗性，可能含有抗胶孢炭疽菌有效生物成分。

图1 ‘香玲’和‘泰勒’青皮体外胶孢炭疽菌侵染

图2 酚类含量较高5类物质

图3 酚类含量较低4类物质

2.2 ‘香玲’和‘泰勒’青皮酚类物质鉴定

根据化合物结构将酚类物质分为原花青素/花青素、苯甲酸及其衍生物、儿茶素及其衍生物、黄酮醇、苯丙素类、黄烷酮/二氢查尔酮、异黄酮/黄酮、萜类、香豆素及其衍生物共9大类。由图2、3可知， ‘香玲’和‘泰勒’青皮酚类物质总量基本一致，分别为610 817.32和608 953.55 ng·g-1，主要以原花青素/花青素、苯甲酸及其衍生物、儿茶素及其衍生物、黄酮醇、苯丙素类这5大类为主，其中‘香玲’青皮以苯甲酸及其衍生物最多，占60%以上，而‘泰勒’青皮以黄酮醇最多，占比接近30%； 9大类物质中，‘香玲’青皮只有苯甲酸类高于‘泰勒’，其余均低于‘泰勒’。

‘泰勒’青皮原花青素/花青素主要以氯化飞燕草素-3-O-葡萄糖苷、原花青素B1/2/3为主，而‘香玲’青皮中绝大部分为氯化飞燕草素-3-O-葡萄糖苷(图4A)； 在苯甲酸及其衍生物和黄酮醇2类物质中，‘泰勒’和‘香玲’青皮主要组成成分一致，但比例各不相同(图4B、C)； 此外，‘泰勒’和‘香玲’青皮中隐绿原酸含量均占苯丙素类物质的80%以上(图4D)。

图4 酚类物质主要成分分析

2.3 胶孢炭疽菌侵染后‘香玲’和‘泰勒’青皮间差异代谢物分析

侵染6天后‘香玲’和‘泰勒’青皮病斑存在明显差异，对两者间差异代谢物分析(表1)可知，与‘香玲’相比，‘泰勒’青皮中上调差异代谢物52个，其中表儿茶素没食子酸酯、对香豆酸、原花青素B1/2/3、樱花亭、异樱花亭、根皮苷等物质差异倍数均在20倍以上，表明这些物质可能与‘泰勒’青皮具有更高的炭疽病抗性有关； 下调差异代谢物8个，即没食子酸甲酯、丁香酸、阿魏酸、鞣花酸等8种物质在‘香玲’中具有较高的含量； 杨梅素、原花青素A2等5种物质仅在‘泰勒’中检测到，而洋蓟素和毛蕊异黄酮仅在‘香玲’中检测到，这体现了品种间特异性。

续表1 Continued

2.4 胶孢炭疽菌侵染后‘香玲’和‘泰勒’青皮出现明显变化的差异代谢物

胶孢炭疽菌侵染第4天，‘香玲’和‘泰勒’青皮病斑与之前一致，但到了第6天，‘香玲’青皮病斑明显增大，‘泰勒’仍无明显变化，说明炭疽菌侵染第4～6天，‘香玲’和‘泰勒’青皮中差异代谢物变化最为关键。如图5所示，‘泰勒’青皮咖啡酸和没食子酸显著上调表达，柚皮素、(S)-圣草酚、扁蓄苷、槲皮苷含量基本不变； 而‘香玲’青皮咖啡酸、没食子酸、柚皮素、(S)-圣草酚、扁蓄苷、槲皮苷6种物质均显著下调表达，尤其以没食子酸下调幅度最大，降至原来的14.36%。以上结果表明，‘泰勒’青皮病斑基本不变可能与咖啡酸和没食子酸显著上调表达有关，而‘香玲’青皮病斑明显增大，可能与咖啡酸、没食子酸、柚皮素、(S)-圣草酚、扁蓄苷、槲皮苷显著下调有关。

图5 胶孢炭疽菌侵染第4～6天‘香玲’和‘泰勒’青皮出现明显变化的差异代谢物

3 讨论

3.1 核桃青皮炭疽病相关酚类物质鉴定

核桃含有大量的不饱和脂肪酸(余启明等， 2020)，是极具发展潜力的木本油料作物。目前，炭疽病的发生且缺乏有效的防控技术是影响我国核桃产业发展的重要因素之一。植物酚类物质是重要的次生代谢物，对细菌、真菌、酵母菌及病毒等具有明显的抑制作用(姚瑞祺， 2011)。核桃青皮中含有大量的酚类物质，万政敏等(2007)利用HPLC鉴定出6种酚酸和3种黄酮，并分析其相对含量； Cosmulescu等(2010)在5种不同核桃青皮中鉴定出阿魏酸、香草酸、香豆酸、丁香酸及杨梅酮5种酚类物质； 郑渝川等(2018)进一步分析了核桃青皮中多酚的种类及抗菌活性。本研究中，‘泰勒’和‘香玲’青皮对胶孢炭疽菌抗性存在明显差异(图1)； 通过代谢组学分析其青皮中酚类物质与炭疽病关联性，结果发现‘泰勒’和‘香玲’青皮中酚类总量基本一致，主要包括9大类物质，但‘香玲’中只有苯甲酸类含量最高，占60%以上，主要以没食子酸、丁香酸、鞣花酸和香草酸等为主，其余均低于‘泰勒’(图2，3，4)，表明‘泰勒’青皮中高含量的原花青素/花青素、黄酮醇、苯丙素类物质与炭疽病抗性相关； 黄酮醇类在‘泰勒’中含量最多，接近30%(图2，3)，主要以金丝桃苷、槲皮苷、扁蓄苷、杨梅苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷为主(图4)，其中金丝桃苷和杨梅素-3-O-半乳糖苷均首次在核桃青皮中报道； 本试验还鉴定到氯化飞燕草素-3-O-葡萄糖苷为‘香玲’和‘泰勒’青皮中主要的花青素物质(图4)。此外，在‘香玲’和‘泰勒’青皮中，仍有许多微量抗炭疽菌酚类物质未被检测到，如乔松素、樱花亭、大波斯菊苷、瑞香素、紫云英苷、桑色素、紫苏醇等。目前，核桃青皮在生产中多当作废弃物丢掉，造成严重的酚类化感作用，因此，充分利用核桃青皮天然酚类物质资源，不仅能防止土壤破坏，还对核桃炭疽病的防治研究工作具有重要意义。

3.2 核桃青皮抗炭疽病有效成分筛选

植物提取物中富含单宁、黄酮、酚酸等酚类物质可作为潜在抗菌药物的有效成分(Limaetal.， 2019)。杨光道等(2007； 2009)研究表明，酚类物质花青素、对羟基苯甲酸和邻苯二酚的含量与油茶炭疽病指数呈负相关，在油茶炭疽病中发挥作用； 曾祥国等(2016)发现草莓(Fragaria×ananassa)中总酚、绿原酸、阿魏酸是‘晶玉’品种具有较强抗炭疽病能力相关的生理因子； Roy等(2018)通过分析草莓中酚酸和类黄酮对炭疽菌的影响，发现反式肉桂酸、阿魏酸和对香豆酸能抑制炭疽菌的生长，其中反式肉桂酸抑制作用最强。在本研究发现‘香玲’青皮病斑在胶孢炭疽菌侵染第4天无明显变化，而第6天明显增大(图1)，说明胶孢炭疽菌侵染第4～6天是关键时期； 分析胶孢炭疽菌侵染6天后‘香玲’和‘泰勒’青皮间差异代谢物，发现表儿茶素没食子酸酯、对香豆酸、原花青素B1/2/3、樱花亭、异樱花亭、根皮苷等物质差异倍数均在20倍以上，结合其在青皮内绝对定量结果(表1)，仅原花青素B1/2/3具有较高含量。 Mikulic-Petkovsek等(2013)研究表明，原花青素与草莓黑斑病相关，因此，结合上述结果，推测‘泰勒’青皮具有较高的炭疽病抗性可能与较高含量的原花青素B1/2/3有关。进一步分析胶孢炭疽菌侵染第4～6天青皮出现明显变化的差异代谢物，本研究发现‘泰勒’和‘香玲’青皮病斑差异与咖啡酸、没食子酸、柚皮素、(S)-圣草酚、扁蓄苷、槲皮苷物质含量变化有关(图5)，表明咖啡酸、没食子酸、柚皮素等6种物质在核桃青皮炭疽病中也发挥重要作用， 其中，赵梅(2013)研究表明，梨果实中咖啡酸对炭疽菌具有一定抗性，其余炭疽病相关酚类物质均首次鉴定。目前，核桃炭疽病防治主要以化学药剂为主，长期使用不仅导致抗药性产生，对环境还造成危害； ，柳凤等(2011)和米嘉琦等(2020)对芒果(Mangiferaindica)肉桂类多酚研究，开发了抑制炭疽病有效物质，为炭疽病防治提出新思路。本研究通过代谢组学筛选到原花青素B1/2/3、咖啡酸、没食子酸、柚皮素、(S)-圣草酚、扁蓄苷、槲皮苷等潜在核桃青皮抗炭疽病有效成分，为后期开发炭疽病相关天然药物提供了酚类物质资源。

4 结论

鉴定核桃抗炭疽病品种‘泰勒’和感病品种‘香玲’酚类物质，代谢物差异分析胶孢炭疽菌侵染后物质动态变化，筛选到原花青素B1/2/3、咖啡酸、柚皮素、(S)-圣草酚、扁蓄苷、槲皮苷和没食子酸等潜在抗炭疽病有效成分，为后期开发核桃炭疽病相关天然抗性药物，探究核桃炭疽病发生机制提供参考。