miRNA对水稻胁迫应答及产量调控影响的研究进展

于雅洁，李绍清

（武汉大学生命科学学院/杂交水稻国家重点实验室，武汉 430072）

MicroRNA（miRNA）是长度为 20~24 nt 的一种内源性非编码小分子RNA，在动植物体内都大量存在［1，2］。水稻（Oryza sativaL.）作为重要的粮食作物，为全球超过1/5 人口提供口粮，但各种生物及非生物胁迫均会对水稻质量及产量产生影响。因而如何提高水稻应对胁迫的能力，并提高水稻产量成为科学家们研究的重点。本研究论述了miRNA 在增加水稻产量和应对水稻胁迫方面的作用，以期为水稻种质资源挖掘和品种改良提供新的研究思路。

1 miRNA 的发现及作用机制

1.1 miRNA 的发现

1993 年，研究秀丽隐杆线虫的生物学家在线虫中发现了一种常见的21 个核苷酸的RNA 片段，将其命名为lin-4。lin-4抑制了核蛋白lin-14 的表达，通过该方式调节线虫发育［3］。

2000 年，科学家在线虫中又发现了一种small RNA。同lin-4类似的是，该small RNA 也可以通过结合一些靶基因mRNA的3′-UTR 而调节线虫的发育，这种 small RNA 被命名为let-7［4］。

为了探究植物中是否存在miRNA，2002 年，遗传学家从拟南芥中分离出了许多微小的RNA 片段，通过克隆所有在microRNA 大小范围内的RNA 并分析了它们序列的某些特征，发现了16 个miRNA，并将其命名为miR156至miR171，这是首次在植物中发现 miRNA 的存在［5］。

近年来，随着高通量测序技术逐渐成熟，已经从多种动植物中鉴定出38 589 条保守的或物种特异的miRNA［6，7］。 这 充 分 说 明 miRNA 研 究 领 域 快 速 发展，并从侧面证明miRNA 广泛参与动植物的生理生化过程。

1.2 miRNA 的作用机制

动植物细胞内的miRNA 均为短序列RNA，不会编码蛋白质，并且都有很高的保守性［8］。动物和植物在miRNA 产生方式上存在差异，并且植物miR⁃NA 和动物miRNA 在进化上是独立进行的，因此植物和动物的miRNA 在序列、前体以及成熟过程等方面都有所区别［9-11］。

动物miRNA 在进化上非常保守，线虫体内55%的miRNA 都可以在人体内发现其同源物［12］。miR⁃NA 在动物中与靶基因 mRNA 的 3′UTR 区特异结合，从而引起mRNA 的降解或抑制蛋白的翻译。其中miRNA 中心位点处与靶基因的结合允许一定数量的碱基错配［13，14］。动物中大多数 miRNA 是 RNA 聚合酶Ⅱ转录的产物，但一些人类miRNA 已被证明是RNA 聚合酶Ⅲ活性的产物［13，15］。

植物miRNA 的合成过程十分精确，miRNA 与靶基因编码区特定位点在植物中会以完全互补（或接近完全互补）的方式结合。通过切割靶基因的mRNA，植物 miRNA 对其进行调控［9］。

2 miRNA 对水稻生物胁迫的调控

全球1/5 的人口以稻米为主要粮食作物。虽然近几十年来水稻产量持续增加，但伴随着农药的广泛使用，水稻生产中病原菌耐药性现象愈发严重，病害发生越来越频繁，病原菌逐渐成为全球水稻生产的主要威胁之一，因此迫切需要提高水稻植株抵御有害微生物的能力，研究发现miRNA 可以从多种途径调控水稻的生物胁迫响应，因而miRNA 成为水稻抗病的一个重要突破口。

2.1 miRNA 对水稻应对稻瘟病的调控

稻瘟病会对水稻产量产生很大的威胁，因而明晰稻瘟病的发病机制及采取有效的预防措施成为稳定水稻产量的重要措施之一。

OsmiR7695是第一个被发现的参与稻瘟病调控网络的miRNA，通过负调控其靶基因OsNramp、OsmiR7695可以促进水稻对稻瘟病的抗性［16］。Li等［17］通过对正常条件下以及在稻瘟病感染时易感植株和抗性植株的小RNA 文库进行深度测序，发现过表达OsmiR160a和OsmiR398b的转基因水稻植株同样表现出对稻瘟病的抗性增强。通过对感病植株和抗性植株的分析，Li 等［18］发现OsmiR169a的表达量在感病植株中明显上升。并且NF-YA 的家族成员作为OsmiR169a的靶基因，其表达量在过表达OsmiR169a的植株中呈下降的趋势。这一结果暗示着OsmiR169通过抑制NF-YA基因的表达从而在水稻对稻瘟病菌的免疫中起负调控作用。在水稻对稻瘟病的抵御中，ARF12基因同样起到重要作用，ARF12是OsmiR167d的靶基因，在过表达OsmiR167d的植株中观察到该基因的表达量降低，同时伴随着植株对稻瘟病的抗性降低，因此OsmiR167d-ARF12调控模块在提高水稻抗病性方面具有一定的应用价值［19］。作为抗稻瘟病的阳性因子，OsTCP21受OsmiR319b的调控。在过表达OsmiR319b的植株中，OsTCP21的表达量降低，而与OsTCP21表达相关的OsLOX2/5的表达量同样呈降低的趋势，最终导致植株对稻瘟病抗病性下降［20］。OsmiR396是水稻中十分重要的小RNA 家族之一，通过抑制多个不同Os⁃GRFs因子的表达，OsmiR396负调控水稻对稻瘟病的抗性，在过表达OsmiR396后，水稻对稻瘟病的抗性下降［21］。植物在防御稻瘟病中的一个有效方法是通过RNAi 系统识别和破坏病毒产生的RNA 分子，而这一过程依赖AGO 家族蛋白，其中就包括AGO1。而 Wu 等［22］发现，OsmiR168会负调控植物内AGO1 的表达，且在感病植株中观察到OsmiR168的表达量上升，除了AGO1 之外，AGO18 可以通过与OsmiR168结合，降低其对AGO1 的影响，从而增强植株的抗病性。

2.2 miRNA 对水稻应对条纹叶枯病的调控

在水稻的常见病害中，条纹叶枯病会对水稻产量造成严重的威胁，因而控制水稻条纹叶枯病的发病也是现阶段科学家们需要攻克的难题之一。

在水稻中，通过抑制OsmiR171b的表达，Tong等［23］发现水稻表现出叶片发育迟缓且叶绿素含量降低的症状，而这一症状与水稻感染条纹叶枯病的症状相似。过表达OsmiR171b的水稻中对条纹叶枯病的敏感性降低，且条纹叶枯病的症状减轻。Wang等［24］发现OsmiR444是 影 响抗 病 毒 信 号 传递 到OsRDR1的关键因素，水稻在被病毒感染后体内Os⁃miR444的表达增强。随后，OsmiR444的过表达进一步增强了水稻对条纹叶枯病的抗性，而抗性的上调则是通过上调OsRDR1的表达实现的。通过进一步分析，他们发现在OsmiR444上调后，OsMADS23、Os⁃MADS27a和OsMADS57作为OsmiR444的靶基因，其对OsRDR1转录的抑制作用被降低。这些结果表明，一个OsmiR444及其MADS box 靶点直接控制OsRDR1转录从而参与水稻抗条纹叶枯病的调控。

为了研究水稻对条纹叶枯病的反应，Yang 等［25］通过深度测序筛选出了与条纹叶枯病相关的miR⁃NA 及mRNA，并进一步通过qRT-PCR 分析所选的miRNA 及mRNA 的表达差异发现，针对条纹叶枯病，OsmiR1423-5p和OsmiR1870-5p表达上调，其对应的靶标基因RPM1和EFRmRNA 表达下调，这证明通过上调相应miRNA 的表达，植物会对条纹叶枯病产生相应的抵御反应。相似地，Yao 等［26］前期试验发现OsmiR528通过调控其靶标基因L Ascorbate Oxidase（AO）的表达，植物表现出对条纹叶枯病抗性降低，说明OsmiR528在植物应对条纹叶枯病中起负调控作用，而后期他们发现，OsmiR528-AO这一防御模块是由转录因子SPL9 所调控，通过特异性结合OsmiR528启动子区域，SPL9 可以正向调控Os⁃miR528的表达，进一步降低AOmRNA 的水平，从而导致水稻对条纹叶枯病的抗性降低。

3 miRNA 对水稻非生物胁迫的调控

非生物胁迫特别是干旱、盐碱等是限制植物生长、发育和农业生产力的因素。因此，如何在外界环境不利于水稻生长的情况下，通过水稻体内的调控网络积极应对非生物胁迫，进而降低外界环境对水稻生长的不利影响，这成为了科学家需要攻克的难点。

3.1 miRNA 对水稻应对干旱的调控

在水稻生产中，由于降雨不足造成的干旱往往会限制水稻的产量。Zhang 等［27］通过对水稻中miR⁃NA 敲除株系的大规模筛选，鉴定出OsmiR166敲除株系（STTM166）的植物表现出卷叶表型，而该表型通常是水稻受到干旱胁迫时所表现的。STTM166水稻植株的叶片具有较小的球状细胞和异常的厚壁细胞，并且STTM166 植株气孔导度降低，蒸腾速率降低，这些变化可以有效地减少植株体内水分的蒸发。敲除OsmiR166后，水稻发生了形态变化，从而一定程度获得抗旱性。Xia 等［28］通过研究发现，作为水稻生长素受体OsTIR1和OsAFB2可以被OsmiR393靶向调节。过表达OsmiR393后，水稻植株的抗旱性降低。Fang 等［29］在研究中发现，OsmiR164靶向的NAC基因是水稻抗旱性的负调控因子，在水稻中有6 个OsmiR164靶向的NAC基因（OMTN1至OMTN6），OMTN2、OMTN3、OMTN4、OMTN6过表达对生殖期抗旱性有负向影响。Tian 等［30］则证明了OsmiR162b通过调节其靶标基因OsTRE1的表达增加了水稻的抗旱性。

3.2 miRNA 对水稻应对冷胁迫的调控

环境条件对植物的生长发育有重要影响。除了干旱条件之外，冷胁迫同样是阻碍作物生长和导致减产的环境胁迫之一。

Xu 等［31］在对水稻的低温胁迫中通过用富氢水预处理，模拟冷胁迫时内源H2产生的生理诱导，而H2的耐冷能力与miRNA（包括OsmiR398和OsmiR319）及其靶基因（包括CSD1、CSD2、PCF5和PCF8）表达水平的变化有部分关系。Tang等［32］发现，水稻中转录因子调控许多与植物耐低温相关的应激反应相关。OsmiR528通过靶向OsMYB30 的正调节蛋白基因（Os06g06050）的F-box区域，降低了转录因子OsMYB30的表达。在OsmiR528转基因水稻中，OsMYB30 表达降低导致 OsBMY2、OsBMY6 和 OsBMY10 表达增加，提示OsmiR528通过调节应激反应相关转录因子的表达来提高低温耐受性。

3.3 miRNA 对水稻应对镉污染的调控

有毒重金属由于其不可降解的性质，可以在植物中积累，最终影响人体健康。作为一种非必需的的重金属，镉污染是造成食物链污染的最重要因素之一，且镉对植物有着很高的毒性。

为了研究miRNA 在镉胁迫下的响应功能，Ding等［33］使用微阵列分析了miRNA 在镉胁迫水稻中的表达情况。在对miRNA 在水稻中镉调控的研究中，Ding 等［34］发现在镉胁迫下，水稻中OsmiR192过表达抑制了种子萌发和幼苗生长。OsmiR390的表达水平在镉胁迫下显著下调。因此作为OsmiR390的靶基因，OsSRK在镉胁迫下表达水平上升。与野生型水稻相比，过表达OsmiR390的转基因水稻对镉的耐受性降低，积累的镉量增加。与此同时，OsSRK在过表达OsmiR390植物中的表达较野生型少。这些结果证明，OsmiR390是水稻抗镉胁迫的负调控因子［35］。2017 年，Ding 等［36］又通过研究发现了Os⁃miR268在水稻镉胁迫中的作用。在镉胁迫下，水稻中OsmiR268的表达明显受到影响。镉处理下的植株中OsmiR268靶基因NRAMP3的表达显著降低。OsmiR268的过表达则使水稻幼苗在镉胁迫下的生长被抑制。过表达OsmiR268的植株叶片中过氧化氢和丙二醛含量增加，幼苗累积的镉含量增加。这些结果表明，OsmiR268是水稻抗镉的负调控因子。2018 年，Ding 等［37］通过研究发现OsmiR166在水稻镉积累及抗性中的作用。OsmiR166靶向编码Ⅲ类同源结构域-亮氨酸拉链（HD-Zip）家族蛋白的基因，过表达OsmiR166增强了水稻对镉的抗性。在镉处理条件下，编码HD-Zip 蛋白的OsHB4基因出现上调，而在过表达OsmiR166的转基因水稻植株中该基因则出现下调。过表达OsHB4使得转基因水稻叶片和子粒对镉的敏感性增强以及镉积累增加。

3.4 miRNA 对水稻应对砷污染的调控

作为广泛存在于自然界的环境类金属，砷对生物有极高的毒性。在水稻中，已有数十种miRNA 被证实对砷胁迫具有响应性。Liu 等［38］发现，过表达OsmiR528（Ubi：：OsmiR528）的转基因植株对砷的敏感度高于野生型（WT）水稻。在砷胁迫条件下，Os⁃miR528-5p和OsmiR528-3p的表达量在植物的根和叶中均显著上调。与野生型植株相比，Ubi：：Os⁃miR528植株在砷暴露后产生过度的氧化应激反应和显著的根、叶氨基酸含量变化。在砷胁迫的条件下，水稻中OsmiR172c会下调表达，从而引起AP2的上升表达，而AP2作为一个与花发育相关的基因，其上升表达会引起水稻从营养生长向生殖生长转变［39］。

3.5 miRNA 对水稻应对盐胁迫的调控

植物会受到盐的特异性影响，细胞内Na+或Cl-浓度过高会导致毒性。面对盐胁迫时，通过调控其靶基因，miRNA 可以介导水稻的盐胁迫反应。

OsmiR319是植物中最早被鉴定和保存的mi⁃croRNA 家族之一，OsmiR319的表达受环境刺激的调控，提示其参与植物应激反应，Zhou 等［40］发现，过表达OsmiR319a的转基因植株会表现出形态变化，同时表现出更强的耐盐性。基因表达分析表明，在过表达OsmiR319a时，至少有 4 个OsmiR319靶基因，即AsPCF5、AsPCF6、AsPCF8 和AsTCP14，以及水稻NAC 域基因AsNAC60的同源基因下调。结果证明OsmiR319控制了植物对干旱和盐碱胁迫的反应。水稻的非生物抗逆性增强与OsmiR319靶基因的显著下调有关。Yang 等［41］通过研究发现，由 T-DNA插入引起的水稻dh 突变体OsmiR171c过表达显著降低了水稻的耐盐性。与野生型（WT）相比，dh 突变型降低游离脯氨酸含量，提高了盐处理后的失水率，叶片表皮气孔密度也增加。在盐胁迫下，dh突变体的几个应激反应基因较野生型明显下调。这些结果表明，OsmiR171c有助于水稻耐盐。除此之外，Xia等［28］发现，过表达OsmiR393的水稻植株耐盐性降低。

作为2 种对盐度有反应的基因，AsAAO和COP⁃PER ION BINDING PROTEIN1的 表 达 量 在Os⁃miR528过表达植株中显著下调，OsmiR528过表达水稻提高了植物对盐的耐受性。Yuan 等［42］试验证明，OsmiR528在调节植物对盐分响应方面发挥关键作用，并表明了操纵OsmiR528可以提高植物非生物抗逆性的潜力。

在OsmiR396对水稻盐胁迫调控的研究中发现，过表达OsmiR396c的水稻植株对盐胁迫耐受性降低。在相同的处理条件下，过表达OsmiR396a/b的转基因植株对盐的耐受性呈上升趋势，这暗示miR⁃NA 同一家族不同成员在胁迫抗性中可能发挥不同作用［43］。

4 miRNA 对水稻产量的影响

大量的研究结果证明，miRNA 对水稻产量具有十分重要的影响。在水稻中，由于miRNA 对靶基因有负调控作用，因此在水稻的调控网络中占据十分重要的地位。

2010 年，Jiao 等［44］发现，IPA1 数量性状位点编码OsSPL14、OsSPL14在体内则是由OsmiR156调控表达。OsmiR156能够通过切割编码OsSPL14的mRNA 负调控其表达。通过研究，他们发现在对Os⁃SPL14进行点突变后，干扰了OsmiR156对OsSPL14的调控，从而产生一个理想的水稻植株。该植株增加了水稻的抗倒伏性，提高了水稻产量。随后Wang等［45］发现，OsmiR156不仅调控OsSPL14，同时会调控OsSPL16，过表达OsmiR156会抑制OsSPL16的表达，导致种子出现细长的表型，从而影响水稻子粒大小，并进一步影响产量。Si 等［46］发现OsmiR156也会调控OsSPL13，而OsSPL13是由一个主要的数量性状位点GLW7 编码，并且正向调节细胞大小，从而提高水稻的谷粒长度，并进一步增加水稻产量。在对OsmiR172的研究进程中，早在 2009 年，Zhu 等［47］就发现过量表达OsmiR172可以延缓水稻的小穗分生组织向小花分生组织转变，这一转变会导致水稻花和种子发育缺陷，产生的这些缺陷会进一步导致水稻产量降低。2014 年，Lee 等［48］发现OsmiR172的过表达会显著缩短开花时间，这意味着OsmiR172具有诱导作用。而研究进一步证明OsmiR172的水平随着植物的衰老而增加。

除此之外，OsmiR396、OsmiR397及OsmiR398均会对水稻产量产生影响。2015 年，Che 等［49］、Duan等［50］、Gao 等［51］都证明OsmiR396调控 GRF 家族的不同成员从而影响水稻产量。OsmiR397是水稻内源性miRNA，作为一个在幼穗和子粒中高表达的基因，当过表达OsmiR397时，水稻的子粒大小会增加，同时促进穗分枝，最终使水稻产量增加25%，这一结果是通过OsmiR397下调其靶点OsLAC所实现的等［52］。在对OsmiR398的研究中，Zhang 等［53］在 2017年通过试验证明，抑制OsmiR398的表达会导致水稻高度明显短于野生型，除此之外，穗长变短、种子数量减少，且开花时间与野生型相比短2 周时间。更重要的是，在粒长与粒宽的比较中，抑制OsmiR398表达的植株表现出明显的减少，进一步导致千粒重降低，进而影响水稻产量。

在水稻分蘖数的研究中，肖之源等［54］发现在过表达OsmiR444.b.2 之后，水稻分蘖增加。利用STTM技术，35 个水稻miRNA 家族的表达水平被降低后，Zhang 等［53］发现 miRNA 参与调控水稻分蘖数。封洁琼等［55］发现，OsmiR156过表达会导致水稻植株出现矮化，并且分蘖增多。而吴美婷［56］研究表明，突变OsmiR390会导致水稻分蘖数增多，同时种子变长。韦懿等［57］则发现超量表达OsmiR167a后，植株表现分蘖数减少。

5 展望

作为最大的基因家族之一，在真核生物中，miRNA占整个基因组的1%左右。尽管近年来许多研究揭示了miRNA 在调控植物生长发育以及环境适应性方面发挥广泛且关键的作用，但依旧有许多miRNA的作用机制尚不清晰［58］。通过综合利用转基因技术、生物信息学技术及高通量测序等技术，可以对miRNA 在水稻中的调控网络中具体发挥的作用进行深层次的分析及验证。随着miRNA 的研究不断深入，提高水稻产量及水稻抗逆性的调控网络也会被进一步完善，并为水稻遗传育种提供新的思路。