10个产地不同生态型种质薄荷引种于天津地区的培育研究*

安娜娜 ，姜琳 ，李希凡 ，冯建明 ，王兰芳 ，李天祥

（1.天津中医药大学，天津 301617；2.中国人民解放军联勤保障部队天津康复疗养中心，天津 300381）

薄荷为唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的干燥地上部分。味辛，凉，归肺、肝经，具有疏散风热，清利头目，解郁，利咽，透疹，疏肝行气的疗效[1]，是临床常用的大宗中药之一。同时，也广泛应用于食品，工业等领域。

薄荷对不同生长环境适应性强，分布区域较广。目前薄荷的主要产区有江苏、河南、河北等地。薄荷无性繁殖和杂交现象普遍，品种（生态型）繁多，不同品种和不同产地外部形态和化学成分含量变化较大。同时，随着人工培植的推广，出现了大量薄荷品种混杂、退化的严重现象[2-3]。近年来，随着对薄荷育种研究不断深入，对于薄荷的资源评价已经从单一方面评价转为综合评价，不但重视薄荷资源经济性状的优劣，同时也更加关注遗传多样性、药效成分差异等方面的系统综合评价。薄荷为沼生湿性植物，天津位于海滨，土壤湿润，适合薄荷的生长。于2017年开始引种薄荷于天津，并相继考察不同居群引种于天津薄荷外观性状差异，拟揭示不同薄荷种质资源的药效活性成分变化规律，最终筛选优良薄荷品种，以生产优质药材。研究通过考察引种于天津不同种质薄荷的外观性状特征，阐明不同产地薄荷的外观形态差异特征，基于薄荷在药典指标成分、其他重要药效成分及生物量为质量考察指标，对不同产地来源品种引种后的药材品质进行系统质量评价，确定优良品种，为进一步开展薄荷选种育种和在天津规模推广种植奠定科学的基础。

1 仪器、试剂与材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪（配置B05型高压梯度泵，UV 1000型全波段可编程紫外可见检测器，CSChrom Plus色谱工作站，美国Alltech科技有限公司）、YHG-600-BS-Ⅱ型远红外快速干燥箱（上海贺德实验设备有限公司）、UV-6100型紫外可见分光光度计（上海美普达有限公司）、调温电热套（山东省鄄城永兴仪器厂）、FA 2104电子天平（上海舜宇恒平科技仪器有限公司）、十万分之一天平（BT25S，赛多利斯科学仪器有限公司）、SB25-12DT超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、移液枪（赛默飞世尔科技有限公司）、挥发油提取器。

1.2 试剂 芦丁对照品（北京索莱宝科技有限公司，NO1009H022）、咖啡酸对照品（北京索莱宝科技有限公司，NO806D025）、迷迭香酸对照品（北京索莱宝科技有限公司，NO228B022）、甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）、甲醇（分析纯，天津市康科德科技有限公司）、乙腈（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）、磷酸（色谱纯，天津市光复精细化工研究所）、95%乙醇（分析纯，天津市康科德科技有限公司）、硝酸铝（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）、氢氧化钠（分析纯，天津市江天化工技术有限公司）、亚硝酸钠（分析纯，天津市江天化工技术有限公司）、娃哈哈纯净水（天津娃哈哈食品有限公司）。

1.3 引种种源和材料 收集自中国主产区江苏盐城、江苏南京、广东广州、河南焦作等10个不同地区的栽培生态型薄荷，经天津中医药大学李天祥教授鉴定，为唇形科植物薄荷Mentha haplocalyx Briq.的根茎，留种于天津中医药大学种质资源圃，2019年春季统一种植。样品信息见表1。

表1 不同产地薄荷种质信息

1.4 引种地概况 本实验地点位于天津市静海区天津中医药大学种质资源圃，位处暖温带半湿润大陆性季风气候区，年降水量500～700 mm，年日照时数2 610～3 090 h，年均温12℃左右[4]，实验田土壤类型为盐化潮土。土壤基本理化性状为pH 5.57，有机质 6.01 g/kg，全氮 0.90 g/kg，全磷 0.089 g/kg，全钾20.00 g/kg，铵态氮 46.40 mg/kg，速效磷 8.10 mg/kg，速效钾56.10 mg/kg。

2 方法

2.1 引种种植方法 采用薄荷根茎进行繁殖，按照行距25～30 cm，株距10 cm移栽，沟深8 cm，横向开沟，将留种的薄荷根茎挖起，选择粗壮、色白、节间较短的新根茎，切成7～10 cm左右的小段作为繁殖材料，平摆于沟内，盖土，踩实，浇水。采用随机区组设计进行实验，以减小实验外部条件的影响，每个品种各设置3个试验小区，随机排列，不同品种之间间隔50 cm，所有品种于2019年5月8日栽植完成。

2.2 外观形状及生物量的测定 采用多点随机混合取样，每个小区分别选取长势一致的薄荷样品，每个产地的薄荷引种天津后于采收期内各随机抽取10株样品，株高、分支用钢卷尺进行测量，叶柄长度用游标卡尺测量，分别称重，结果取算数平均值。采集的样品在同一条件下阴干，装入封口袋中密封冷藏、备用。

2.3 挥发油含量测定 取不同品种薄荷药材样品，分别精密称取过3号筛（50目）的薄荷粉末40 g，置于1 000 mL圆底烧瓶中，加水500 mL，少量碎瓷片，摇匀，按照2020版《中华人民共和国药典》挥发油测定法（通则2204挥发油测定法甲法）提取挥发油，控制温度使之微沸3 h，停止加热，冷却至室温，待其分层后，保持视线与凹液面最低点平齐，读取挥发油测定器读数并收集所得挥发油，加入少量无水硫酸钠，静置。每个产地平行操作3次，计算平均得油率。

2.4 总黄酮含量测定

2.4.1 对照品储备液的制备 将芦丁对照品干燥至恒重，精密称取5.0 mg，用浓度30%的乙醇溶解于25 mL的容量瓶中，即得浓度0.2 mg/mL的对照品储备液。

2.4.2 供试品溶液的制备 精密称取过3号筛（50目）的薄荷粉末1 g，置于250 mL的锥形瓶中，加入30 mL 40%乙醇溶液，50℃水浴1 h，然后超声提取 40 min（功率 500 W、频率 40 kHz），冷却后，过滤。滤液用30%乙醇定容至100 mL，摇匀。

2.4.3 显色及测定方法 取供试品溶液0.2 mL置于10 mL容量瓶中，加入30%乙醇2 mL，5%NaNO20.3 mL，摇匀，避光静置5 min，加入10%Al（NO3）30.3 mL，避光静置 5 min，加入 4%NaOH 2 mL，摇匀使其完全反应，用30%乙醇溶液定容至刻度线，避光静置15 min，即得。以显色剂为空白，于510 nm波长处测定吸光值。

2.5 有机酸类成分含量测定

2.5.1 对照品溶液的制备 咖啡酸：精密称定咖啡酸对照品4.3 mg，置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇定容，即得浓度为0.43 mg/mL咖啡酸对照品储备液，精密移取咖啡酸对照品储备液1 mL于10 mL容量瓶中，定容，即得浓度为43 μg/mL的咖啡酸对照品溶液。迷迭香酸：精密称定迷迭香酸对照品6.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇定容，即得浓度为0.6 mg/mL迷迭香酸对照品储备液。

2.5.2 供试品溶液的制备 咖啡酸：精密称取薄荷样品粉末1 g，置于150 mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定质量，超声提取40 min，冷却至室温后称质量，用50%甲醇补足失质量，摇匀，滤过，取续滤液，置50 mL容量瓶中，定容，即得供试品溶液。迷迭香酸：精密称取薄荷样品粉末1 g，置于150mL具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，称定质量，超声提取40 min，冷却至室温后称质量，用50%甲醇补足失质量，摇匀，滤过，取续滤液，置50 mL容量瓶中，定容，从中精密移取1 mL，置10 mL容量瓶中，定容，即得供试品溶液。

2.5.3 色谱条件 咖啡酸：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）；等度洗脱 11%（A）～89%（B）；流速0.8 mL/min；检测波长321 nm；柱温25℃。迷迭香酸：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）～0.1%磷酸水（B）；等度洗脱20%（A）-80%（B）；流速 1 mL/min；检测波长 330 nm；柱温30℃。见图1。

图1 对照品（A、B）和薄荷样品（C、D）HPLC色谱图

2.6 方法学考察

2.6.1 线性关系考察 分别精密吸取各对照品储备液适量，按相应方法制成系列浓度的对照品溶液，按“2.4.3”项下方法测定吸光度、“2.5.3”项下方法测定峰面积，以对照品溶液的浓度为横坐标（X），吸光度或峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，结果见表2。

表2 线性关系考察

2.6.2 重复性考察 依据上述供试品溶液制备方法分别取同一样品各制备6份，按“2.4.3”“2.5.3”项下方法进行测定，计算得到总黄酮吸光度的RSD为0.73%，咖啡酸、迷迭香酸峰面积的RSD分别为1.71%、2.59%，表明方法重复性良好。

2.6.3 精密度实验 取各对照品溶液，按“2.4.3”“2.5.3”项下方法分别连续进样测定6次，计算得到总黄酮吸光度的RSD为0.02%，咖啡酸、迷迭香酸峰面积的RSD分别为1.34%、1.20%，表明仪器精密度良好。

2.6.4 稳定性实验 取各薄荷供试品溶液，每隔10 min在510 nm波长下测定吸光度，连续在1 h测定其稳定性，计算得到总黄酮吸光度为RSD=1.14%；分别于 1、2、4、8、10 和 12 h 进样测定峰面积，得咖啡酸峰面积 RSD=2.83%；分别于 0、2、4、8、12 和 24 h 进样测定峰面积，得迷迭香酸峰面积RSD=2.57%，表明各供试品溶液在相应的检测时间内稳定性良好。

2.6.5 加样回收率考察 精密称取已知成分含量的各薄荷供试品，分别加入对照品储备液适量，按“2.4.3”“2.5.3”项下方法分别连续测定6次，计算加样回收率结果芦丁的平均回收率为100.80%，RSD为1.90%，咖啡酸的平均回收率为99.60%，RSD=2.40%，迷迭香酸的平均回收率为102.26%，RSD=2.72%，表明本试验方法稳定可行。

2.7 样品含量测定 采用SPSS 23.0软件分析统计，计量资料符合正态分布，用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Waller-Duncan检验。检验水平α=0.05，P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 引种薄荷的形态指标 天津引种薄荷主要外观性状如表3所示。10种不同产地薄荷在春季引种至天津后，外部形态呈现多样性，尤其是茎的颜色区别较大。在同等栽培密度条件下，各产地薄荷株高差异较大，其中河北安国为80.42 cm，远高于其他产地，且具有显著性差异（P<0.05）。河北鹿泉、河北安国、河北秦皇岛和吉林长春样品茎色呈紫色，其他茎色均为青绿色。品种间茎节数变化范围为12.75～25.33个，江苏盐城显著高于其他品种。品种间分枝数变化范围为15.91～32.33个，河北安国显著高于其他地区。品种间分枝长变化范围为9.45～63.9 cm，河北安国显著高于其他品种（P<0.05）。叶柄长度以吉林长春最高为1.46 cm，显著高于其他产地样品（P<0.05）。

表3 10个栽培品种薄荷数量多态性状（±s）

表3 10个栽培品种薄荷数量多态性状（±s）

注：同一列没有相同英文字母者，表示差异有统计学意义（P<0.05）；有相同英文字母者，则表示差异无统计学意义。

编号 株高（cm） 茎节数（个） 分枝数（个） 分支长（cm） 叶柄长（cm）广东广州 38.60±10.61cd 19.00±2.83c 24.00±1.41abcd 35.80± 5.94bc 1.08±0.25ab江苏盐城 56.40± 8.89b 25.33±2.24a 29.67±3.32ab 45.88±13.08ab 0.72±0.34bcd江苏南京 43.56± 3.69bc 21.30±2.58abc 27.00±4.32abc 34.29±12.94bcd 0.48±0.23cd河南焦作 39.25± 7.10c 16.73±3.64cd 15.91±2.84d 20.12± 8.46cde 0.77±0.19bcd河南信阳 38.70±10.75cd 20.30±2.41bc 21.20±2.62bcd 25.25±11.04cde 0.93±0.24bc河北平山 42.82± 6.35bc 21.40±2.80abc 26.90±7.03abc 36.86± 5.36bc 0.41±0.08d河北鹿泉 28.08± 6.48cd 13.75±2.06d 17.25±1.89d 9.45± 3.61e 0.81±0.03bcd河北安国 80.42±12.28a 24.50±2.66ab 32.33±9.46a 63.95±18.19a 0.79±0.22bcd河北秦皇岛 43.63± 3.35bc 21.33±1.53abc 19.00±5.00cd 15.33± 3.00de 0.63±0.29bcd吉林长春 23.13± 1.02d 12.75±1.26d 16.75±0.96d 10.78± 2.41e 1.46±0.30a n 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10茎色青绿色青绿色青绿色青绿色青绿色青绿色紫色紫色紫色紫色

3.2 引种薄荷的生物量测定 由表4可知，各产地薄荷引种天津后生物量差异较大（P<0.05），其中河北安国，江苏盐城薄荷生物量较大，与“3.1”中薄荷形状分析结果基本一致，表明植株株高、分枝数、分支长等性状与生物量存在一定的正相关，分支较多，茎叶繁茂的薄荷生物量相对较大，植株外部性状指标可以为考察其生物量及产量、筛选优质品种提供一定的依据。

表4 不同产地薄荷引种天津生物量测定结果（±s）

表4 不同产地薄荷引种天津生物量测定结果（±s）

注：同一列没有相同英文字母者，表示差异有统计学意义（P<0.05）；有相同英文字母者，则表示差异无统计学意义。

产地 n 生物量（g）广东广州 10 82.86±18.50bc江苏盐城 10 88.86±22.13b江苏南京 10 52.82±24.29cd河南焦作 10 59.79±25.71c河南信阳 10 78.35±28.89bc河北平山 10 75.40±22.21bc河北鹿泉 10 31.70±10.22d河北安国 10 142.76±32.75a河北秦皇岛 10 24.61± 8.41d吉林长春 10 30.66±11.36d

3.3 引种薄荷中主要功效成分的含量测定 如表5所示，基于药典指标成分挥发油，各品种之间含量差异较大（P<0.05）。江苏盐城和河南信阳样品含量最高，均为2.54%，各个产地品种于0.80%～2.54%，最高者是最低者3倍以上，药材质量参差不齐，但各引种品种药材的指标成分均满足药典规定标准（0.80%），说明薄荷引种天津后，生态适应性良好，药效物质积累较为丰富，具有规模引种的可能性。基于薄荷总黄酮含量，各产地于96.36～168.21 mg/g，最高者为河北安国及江苏盐城薄荷，分别为168.21 mg/g、165.68mg/g，且与其他产地相比存在显著性差异，两地薄荷药效成分总黄酮的含量较丰富，表明此两种薄荷在发挥祛痰、抗氧化和镇痛的功效方面具备一定优势。基于有机酸类成分，各产地咖啡酸含量于0.09～0.53 mg/g，各品种含量差异较大，最高者为江苏盐城薄荷，咖啡酸含量为0.53 mg/g，与其他产地相比存在显著性差异；各产地迷迭香酸含量于1.01～13.59 mg/g，最高者是最低者的10倍以上，各品种含量差异较大，其中河北安国的薄荷品种迷迭香酸含量较高，迷迭香酸含量为13.58 mg/g，与其他产地相比存在显著性差异。

表5 不同产地薄荷引种天津药效组分含量测定结果（±s）

表5 不同产地薄荷引种天津药效组分含量测定结果（±s）

注：同一列没有相同英文字母者，表示差异有统计学意义（P<0.05）；有相同英文字母者，则表示差异无统计学意义。

迷迭香酸（mg/g）广东广州 3 1.00±0.00bc 115.03±1.38bd 0.16±0.03d 1.34±0.23e江苏盐城 3 2.54±0.19a 165.68±4.50a 0.53±0.02a 6.86±0.24b江苏南京 3 0.83±0.00c 128.08±4.08b 0.39±0.02b 4.14±0.06c河南焦作 3 2.21±0.07a 99.59±4.49cd 0.10±0.01ef 4.11±0.05c河南信阳 3 2.54±0.26a 99.63±1.02c 0.12±0.01e 2.44±0.17d河北平山 3 1.19±0.09bc 100.21±0.79c 0.09±0.01f 4.14±0.08c河北鹿泉 3 0.80±0.00c 96.36±2.22c 0.16±0.02d 2.31±0.30e河北安国 3 1.81±0.27abc 168.21±7.70a 0.10±0.01ef 13.58±0.02a河北秦皇岛 3 0.87±0.01c 116.49±2.64bd 0.22±0.01c 7.53±1.07b吉林长春 3 1.32±0.00b 101.35±2.22c 0.09±0.02f 1.01±0.24e产地 n 挥发油（%）总黄酮（mg/g）咖啡酸（mg/g）

4 讨论

实验开展了来自10个不同产地的薄荷品种在天津引种大田实践。实验结果显示，从外观性状分析数据来看，河北安国、江苏盐城2个产地的品种分支较多，外部形态性状较优；从药效成分含量分析，江苏盐城薄荷挥发性成分和非挥发性成分含量均占据一定优势，河南信阳薄荷挥发油含量也较高。河北安国薄荷挥发油含量低于江苏盐城品种，但其总黄酮成分和有机酸类成分中的迷迭香酸含量丰富，河北秦皇岛的薄荷品种迷迭香酸含量丰富。其中河北安国与天津位于同一纬度带，同属温带大陆性季风气候，年均温、降雨量、日照时长等基本一致，这在一定程度上致使其种质资源在天津地区生长适应性良好，植株较高，茎秆粗壮，叶片繁茂。江苏作为薄荷的传统道地产区，在长期的栽培过程中，通过自然选择或人工选育筛选出了产量较高、抗逆性好、生态适应性强的优质品种资源，推测这是其在异地引种品质仍较优的重要原因。

薄荷属于长日照植物，充足的光照可促进薄荷开花，有利于薄荷油、薄荷脑的积累，一般土壤均能栽培[5]。天津地处温带大陆性季风气候区，夏季高温干燥，气候有利于薄荷挥发油的积累。试验田土壤类型为盐化潮土，盐碱化程度较高，虽然存在泛碱、泛盐的情况，但盐碱粘粒土壤中毛细管作用在将盐、碱输送至土壤表层的同时，有效提高了土壤表层与底层的养分交换能力，使土壤肥力常新[6]，能满足薄荷快速生长所需的丰富矿物质元素。李玉梅等[7]研究发现东北薄荷对混合盐胁迫具有较强的耐受性，且低浓度混合盐胁迫对东北薄荷种子萌发具有一定的促进作用，由此可见虽然薄荷本身为沼泽湿生植物，但其对黏重盐渍化土质有较强耐受，本实验引种后也发现天津盐渍化土壤较适合薄荷的生长，生物量较高。因此，基于薄荷适应性强的生物特性和药用价值高，在天津推广种植薄荷具备一定可行性和经济价值。目前，在薄荷种质研究上主要重视产油量较高的薄荷品种的收集和保存，却忽略抗性资源的收集的情况。因此，在本实验的基础上，应进一步扩大试验面积，考察不同品种的抗逆性、抗病性，加强对野生资源的收集和研究。

5 结论

本研究收集的薄荷品种丰富，具有多样性，有较大的挖掘和应用价值，为薄荷选种育种提供了充足的材料。其中江苏盐城和河北安国的薄荷品种种质优良，药效物质含量丰富，挥发油含量远远满足药典要求，生物量较大，产量高，在天津盐渍化土壤引种后生长适应性强，经济性状好，在天津推广引种具备一定可行性。