不同来源牡丹皮总黄酮含量分析

程丹丹，罗 晓，王仕越，罗振晖，袁文鹏

(齐鲁工业大学(山东省科学院)/山东省科学院菏泽分院/山东省生物工程技术创新中心，山东 菏泽 274000)

牡丹皮为芍药科植物牡丹(Paeonia suffruticosa)的干燥根皮，具有清热凉血、活血化瘀等功能[1]。牡丹皮主产于安徽、山东、陕西、河南、四川等地。全国大部分区域皆有牡丹的野生资源分布和人工栽培。由于气候、历史、人文风俗等诸多因素影响，中国牡丹栽培种群主要分布在黄河流域。中国牡丹野生资源极为丰富，主要分布在云南横断山脉、甘肃乌鼠山、 四川巴山、河南阳山、陕西秦岭山脉、湖北鄂西山地、山西吕梁山脉、台湾大雪山和大塔山等[2—3]。然而，由于对野生资源重视程度不够以及市场上没有明确的质量标准，牡丹皮饮片管理较为混乱，不同产地、不同种植方式的丹皮化学成分含量有较大差异，从而造成不同来源的牡丹皮功效有明显差别，严重影响到在配伍组方、中成药的配方用量和疗效。牡丹皮含有多种化学成分，发挥药效作用的主要有丹皮酚类、芍药苷类、总黄酮类等。近期研究表明，黄酮类具有较强的生物活性[4—6]，为了控制牡丹皮的质量，初步以总黄酮含量为评价指标。本研究对牡丹皮总黄酮的提取工艺进行优化并对 11份来自不同产地的野生和栽培牡丹皮总黄酮含量进行分析，获得最佳提取工艺，并初步评价不同产地栽培、野生材料中总黄酮含量情况，为牡丹野生物种的保护和开发利用提供依据，亦为牡丹皮的质量控制、临床应用等提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

无水乙醇(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)、亚硝酸钠(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)、硝酸铝(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)、氢氧化钠(分析纯，西陇科学股份有限公司)、石油醚(60～90 ℃，分析纯，天津市大茂化学试剂厂)、中草药粉碎机(FW1777，天津市泰斯特仪器有限公司)、超声波清洗器(KQ-300B，昆山市超声仪器有限公司)、分析电子天平(FA2004C，常州万泰天平仪器有限公司)、数显恒温水浴锅(HH-S4，江苏金怡仪器科技有限公司)、循环水真空泵[SHZ-D(III)，巩义市予华仪器有限责任公司]双光束紫外可见光分光光度计(T2602S，上海佑科仪器仪表有限公司)。

1.2 材料

不同来源牡丹皮标本编号、产地等信息见表1。

表1 牡丹皮材料来源Table 1 Sources of moutan cortex materials

1.3 方法

1.3.1 标准曲线确定

准确称量芦丁标准品0.0180 g，用60%乙醇溶解并定容至50 mL，摇匀，得到360 μg·mL-1对照品溶液备用。

分别取对照品溶液0、2、4、6、8、10 mL于试管内，依次加5% NaNO22 mL、10% Al(NO3)32 mL、1 mol·L-1NaOH 20 mL，每种试剂滴加间隔5 min，用60%乙醇溶液稀释定容，得到不同浓度标准液。

采用紫外–可见光分光光度法于510 nm波长下测量其吸光度[7]。以标准液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程 ：A=0.0114C，R2=0.9952

1.3.2 样品显色测定

取待测样品2 mL于50 mL容量瓶内，按照1.3.1加入显色剂，用60%乙醇稀释并定容，摇匀备用。显色稳定后，采用紫外-可见光分光光度法在510 nm波长处测量吸光度。

1.3.3 丹皮中总黄酮提取工艺优化

通过单因素试验、响应面分析法综合优选最佳提取工艺。每份称取3.0 g处理后的牡丹皮粉末，按以下实验设计进行总黄酮的提取，得到提取液。按照1.3.1测定吸光度，计算黄酮含量。

1.3.3.1 单因素试验

考察提取时间、乙醇浓度、提取温度、料液比四因素对总黄酮得率的影响[8]。

通过预实验，设定乙醇浓度 60%，提取温度60 ℃，料液比(g/mL)1:30，提取时间60 min，分别考察不同提取时间(30、60、90、120 min)、乙醇浓度(20%、40%、60%、80%)、提取温度(40、50、60、70 ℃)、料液比(1:20、1:30、1:40、1:50)对总黄酮得率的影响。

1.3.3.2 响应面分析法

选取提取时间(A)、乙醇浓度(B)、提取温度(C)、液料比(D)4个因素进行Box-behnken响应面试验设计[9—11]。对提取时间(X1)、乙醇浓度(X2)、提取温度(X3)、液料比(X4)的响应面因素水平编码见表2。

表2 响应面水平因素编码Table 2 Response surface horizontal factor coding

1.4 不同产地牡丹皮总黄酮含量测定

取11个来源的牡丹皮药材各100 g粉碎后过4号筛，置于大烧杯以料液比1:8加入石油醚浸泡过夜，抽滤，将晾干的药渣按料液比 1:50(g/mL)加入50%乙醇，64 ℃超声提取65 min，抽滤，滤液备用。

总黄酮含量测定：以芦丁作为标准品，采用紫外–可见光分光光度法进行含量测定。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图2可知，当提取时间为60 min时，提取液中总黄酮的含量达到峰值，随后又下降，表明此时提取液中总黄酮含量达到饱和(图2: A)。当乙醇浓度为40%时，提取液中总黄酮含量最高，表明适宜的乙醇浓度为40%(图2: B)。当提取温度为60 ℃时，提取液中总黄酮含量达峰值，随后迅速下降，故最佳提取温度确定为60 ℃(图2: C)。当料液比为1:40时，提取液中总黄酮含量达峰值，随后缓慢下降，表明此料液比下提取的总黄酮含量最高(图2: D)。

图2 提取时间、乙醇浓度、提取温度和料液比对总黄酮得率的影响Fig. 2 Effect of extraction time, ethanol concentration, temperature and solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.2 响应面分析法

2.2.1 响应面分析结果

响应面分析法优化牡丹皮总黄酮提取的结果见表3。

表3 响应面分析实验结果Table 3 The results of the response surface analysis experiment

2.2.2 模型方程的建立与方差分析

通过 Design-expert 软件对表 3数据进行二次回归拟合，得到提取时间(X1)、乙醇浓度(X2)、提取温度(X3)、液料比(X4)4个因素与总黄酮得率(Y)的二次 多 项 式 回 归 方 程 ： Y=25.80+0.19X1–0.81X2–0.06X3+2.83X4+0.31X1X2+0.74X1X3+0.23X1X4–0.07X2X3–2.13X2X4+1.11X3X4–1.54X12–2.74X22–1.55X32–2.41X42。该回归多项式方程的总决定系数R2=0.9262，表明该二次多项式回归方程可信度高，方程能较好地预测和分析总黄酮得率。

对上述回归模型进行方差分析，结果见表 4。通过方差分析，该二次多项式回归方程模型F值为12.13，P＜0.0001，表明该模型具有统计显著性。失拟项P=0.8021＞0.05，不显著，表明该模型可信度高，能较好地预测和分析总黄酮得率。从表4可知，4个因素对总黄酮得率的影响顺序为液料比＞乙醇浓度＞提取时间＞提取温度。

表4 牡丹皮中总黄酮得率方差分析Table 4 Variance analysis results of total flavonoids yield in cortex moutan

由表5和表6可知，二次多项式模型拟合实验数据效果好，可较好地预测和分析总黄酮得率。

表5 模型可信度分析Table 5 Reliability analysis of the model

表6 模型置信度分析Table 6 Model confidence analysis

2.2.3 最佳提取工艺参数预测

采用响应面法，可得牡丹皮总黄酮的最佳提取工艺为提取温度63.989 ℃，乙醇浓度50.077%，料液比1:49.080，水浴加热提取65.195 min。该条件下总黄酮得率预测值为27.315 mg·g-1。在实验室条件下对提取条件进行修正：在提取温度64 ℃下，乙醇浓度50%，料液比为1:50(g/mL)，提取时间65 min。

2.2.4 最佳提取工艺参数验证

为了考察优化工艺的稳定性、可行性，在该工艺条件下，进行重复性试验3次，总黄酮得率见表7。由表7可知，总黄酮得率平均值为27.540 mg·g-1，与理论预测值 27.315 mg·g-1的相对标准偏差为1.83%，说明该工艺稳定可行。

表7 验证实验Table 7 Validation results

通过单因素试验、响应面法综合考察，得出提取总黄酮的最佳方案为料液比为 1:50，乙醇浓度50%，提取温度64 ℃，超声时间65 min。

2.3 不同产地牡丹皮总黄酮含量测定

由表8可知，11个不同产地、不同生长类型的牡丹皮总黄酮含量存在较大差异，含量较高的为陕西商洛、陕西略阳、河南辉县的野生牡丹皮，分别为 64.035 mg·g-1、62.632 mg·g-1、51.140 mg·g-1。含量较低的为云南昆明栽培牡丹皮和四川米仓山野生牡丹皮，分别为 30.439 mg·g-1、33.859 mg·g-1。

表8 不同来源牡丹皮总黄酮的含量Table 8 Determination of total flavonoids in moutan cortex from different source

3 讨论

通过单因素实验、响应面分析法优化了牡丹皮总黄酮提取工艺。从单因素分析可见，牡丹皮总黄酮提取得率随料液比、乙醇浓度、提取温度、提取时间的增加而提高。结合响应面法分析，确定最佳的提取工艺为料液比1:50，乙醇浓度 50%，提取温度64 ℃，提取时间65 min。

目前，河南洛阳、山东菏泽为观赏牡丹及种苗主产区，安徽铜陵和亳州为药用牡丹主产区，牡丹栽培技术逐步提升，栽培范围也逐渐扩大。我国虽有得天独厚的牡丹野生资源，但由于重视不足，使得野生资源未被充分利用。另外，市场上牡丹皮药材较为混乱，不同来源的野生或栽培类型的牡丹皮药效比较研究较少。本研究分析11个不同产区的野生和栽培牡丹皮总黄酮含量，表明不同来源的牡丹皮总黄酮含量差别较大，总的来看，野生牡丹皮总黄酮含量高于栽培牡丹皮药材；从野生牡丹皮产地分析，陕西等西北地区的总黄酮含量较高，安徽、云南等地区的总黄酮含量较低。