基于高通量测序技术比较雄性和雌性黑貉肠道菌群间的差异

朱宇航，朱言柱，司华哲，李 雪，姜恩泽，宋兴超，贾 赟，徐 超*

(1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118；2.中国农业科学院特产研究所，吉林长春 130000；3.铜仁学院，贵州铜仁 554300；4.大连海关技术中心，辽宁大连 116000)

貉(Nyctereutesprocyonoides)属于食肉目犬科，是一种重要的毛皮经济动物[1]。目前，对貉肠道微生物进行的研究不多，通过比较貉与蓝狐(Alopexlagopus)的肠道菌群[2]，发现狐与貉的肠道菌群存在一定差异。在貉的日粮中添加益生菌，可改变肠道菌群组成和群落结构，增加其体重[3]。肠道微生物是存在于哺乳动物胃肠道和附着在黏膜和表皮细胞等位置的微生物的总称。研究表明，肠道微生物的组成结构及其功能与宿主的代谢[4]和免疫[5]密切相关，影响宿主的健康或疾病的发展。肠道微生物在宿主免疫系统的诱导过程中发挥重要作用。通过与潜在的病原体争夺营养和附着位点，肠道共生菌形成重要的屏障，阻止病原体在肠道定植[6]。盲肠和结肠微生物的主要功能是发酵膳食纤维并产生短链脂肪酸[7-8]，短链脂肪酸为微生物和肠道上皮细胞提供能量来源，维持肠道上皮的完整性[9]。除了正常菌群，肠道内还定植着一些致病菌，如产气荚膜菌、沙门氏菌和大肠埃希氏菌等[10]，损害宿主的健康。

日粮变化是肠道微生物变化的最大影响因素之一，在人类及小鼠已中发现日粮对肠道微生物的影响与宿主性别相关[11]。目前，已有许多研究关注性别对肠道微生物的影响[12-14]。在林麝(Moschusberezovskii)中[15]，雄性林麝菌群的多样性和丰富度都高于雌性，但是差异并不显著。崔磊[16]对鸡肠道菌群进行研究，发现公鸡空肠内容物中菌群多样性低于母鸡，但在十二指肠、回肠和盲肠高于母鸡；公鸡十二指肠和空肠菌群丰度低于母鸡，但在回肠和盲肠高于母鸡。在大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)中发现，性别在肠道菌群差异中的作用是与年龄相关的，亚成体及成体雌性熊猫的肠道微生物群落多样性高于雄性，老年雌性熊猫的肠道微生物群落多样性要低于雄性[17]。小鼠的肠道微生物某些类群的相对丰度与性别相关[18]。目前，对于貉肠道微生物在性别间的差异还未见报道。

本试验对雄貉和雌貉的肠道微生物进行16S测序，分析冬毛期雌貉与雄貉肠道微生物菌群组成及结构差异，并对菌群进行功能预测，从肠道微生物的角度评估是否需要对冬毛期不同性别貉进行差别饲养。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 本试验所用黑貉来自中国农业科学院特产研究所毛皮动物饲养基地，24只健康的成年黑貉(10月龄)，12只雄貉(M1～12，体重为7.55 kg±1.19 kg)，12只雌貉(F1～12，体重为6.67 kg±0.67 kg)。

1.1.2 所用饲料 该饲养场日常饲粮的成分及营养水平见表1。

表1 饲粮组成及营养水平

1.1.3 主要试剂 无水乙醇、氯仿、异戊醇、TE缓冲液，北京伊诺凯科技有限公司产品；高保真酶，TOYOBO公司产品；GeneJET胶回收试剂盒，Thermo Scientific公司产品；TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建库试剂盒，Illumina公司产品。

1.1.4 主要仪器 高速冷冻离心机(1-2-204)，北京三联顺达商贸中心产品；梯度PCR仪(T100)，北京依珊汇通科技有限公司产品；核酸电泳仪(DYY-8C)，北京六一生物科技有限公司产品；凝胶成像分析系统(JY04S-3C)，北京君意华鑫科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 于2020年2月10日，采集黑貉新鲜的粪便分装至无菌采样管，做好标记，立即放入液氮中低温保存，用于后续试验。

1.2.3 测序数据处理 使用Qiime 1.9.1对原始数据进行质量控制。通过(https://github.com/torognes/vsearch/[19]与物种注释数据库进行比对，去除其中的嵌合体序列，得到有效数据。以97%的一致性将序列聚类成为分类操作单元(operation taxonomic units，OTU)，并对OTU序列进行物种注释，设定阈值为0.8～1，获得分类学信息并统计各样本在各个分类水平的群落组成。

使用Qiime 1.9.1计算Observed-species、Chao 1、Shannon、Simpson、ace、Goods-coverage指数以及Unifrac距离。使用R 2.15.3绘制稀释曲线、物种累积曲线和PCoA图。提取KEGG数据库原核生物全基因组16S rRNA基因序列并利用Blastn算法将其比对到SILVA SSU Ref NR数据库(Blast bitscore >1 500)建立相关矩阵，实现SILVA数据库功能注释。测序样品以SILVA数据库序列为参考序列聚类出OTU，进而获取功能注释信息。基于数据库注释结果，同时做t检验差异分析。

1.2.4 统计分析 采用SPSS 20.0软件进行数据统计分析，选用t检验进行组间差异显著性分析，P<0.05表示差异显著。所有的结果都以平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 测序数据总结及α多样性分析

得到1 481 402个有效序列(雄貉759 021条，雌貉722 381)。单个样品中，有效序列最少为53 598条，最多为68 452条。以97%的一致性进行OTU聚类，共得到18 178个OTUs。所有样品的覆盖率均超过99.8%。每个样品的具体参数见表2。从稀释曲线和物种累计曲线图(图1)可见，本试验的样品数量和测序深度都以足够反映试验貉肠道菌群的多样性信息，满足后续分析要求。根据样本测序数据，雌貉与雄貉肠道菌群的观测物种数差异显著，Shannon指数和ACE指数均无显著差异。

图1 稀释曲线(A)和物种累计箱型图(B)

表2 样本测序数据分析

2.2 肠道菌群在门和属水平上的分布

以进行物种注释过的OTU为基础，发现所有样品中的细菌可归属24个菌门。其中优势菌门见图2。在门的水平上，雌貉和雄貉的肠道菌群均以厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)为主，3个菌门所占比例相加均超过98%。Firmicutes在雄貉和雌貉中所占比例分别为58.27%±8.00%和61.05%±13.59%，丰度最高。Bacteroidetes在雄貉和雌貉中所占比例分别为36.51%±9.44%和33.80%±14.76%，为第二优势菌门。Proteobacteria在雄貉和雌貉中所占比例分别为3.37%±2.01%和3.24%±2.46%，在各菌门中占比第三高。各菌门相对丰度在组间均没有显著差异。

图2 肠道菌群门分类的相对丰度

在所有的样品中，总共发现273个菌属，优势菌属见图3。雄貉与雌貉肠道菌群的主要优势菌属均为Streptococcus(雄貉8.15%±2.51%；雌貉7.91%±4.74%)、Bacteroides(雄貉4.05%±1.32%；雌貉4.17%±2.08%)、Phascolarctobacterium(雄貉 3.70%±0.84%；雌貉4.63%±1.19%)、Lactobacillus(雄貉2.82%±2.23%；雌貉1.85%±1.38%)、Blautia(雄貉3.43%±0.63%；雌貉3.28%±0.94%)和Alloprevotella(雄貉3.13%±0.66%；雌貉2.98%±0.80%)。各菌属相对丰度在组间均无显著差异。

图3 肠道菌群属分类的相对丰度

2.3 群落结构与组成的差异分析

2.3.1 主成分分析及组间群落结构差异显著性检验 用Unifrac weighted distance在属水平上检验雌貉与雄貉肠道菌群群落结构的差异(图4)。图中每个点代表1个样本，发现取自雄貉和雌貉的样本分离并不显著，使用Adonis方法检验组间群落结构差异的显著性，说明雌貉与雄貉肠道菌群的群落结构和组成差异不显著(P>0.05)。

图4 UniFrac加权主坐标分析图

2.3.2 功能预测 通过PICRUST功能预测，可以看到一些在雌貉和雄貉肠道菌群之间存在显著差异(P<0.05)的功能。由图5可知，雌貉菌群中一些二级KEGG途径，如脂质代谢、氨基酸代谢、信号传导、细胞运动、膜转运和环境适应等与雄貉相比显著上调(P<0.05)，而雄貉肠道菌群中碳水化合物代谢、能量代谢、辅酶因子和酶家族等功能与雌貉相比显著上调(P<0.05)。

图5 功能基因预测及差异分析

3 讨论

本试验基于高通量测序比较了人工养殖环境下雄貉与雌貉肠道微生物的差别。通过对黑貉肠道菌群进行多样性分析可知，雌貉肠道微生物的物种数目显著高于雄貉(P<0.05)，虽然雌貉与雄貉肠道菌群的ACE指数和Shannon指数差异并不显著(P>0.05)，但是雌貉肠道菌群ACE指数和Shannon指数都高于雄貉，这说明雌貉肠道菌群的多样性和丰富度都高于雄貉，性别对黑貉肠道菌群的多样性和丰富度存在影响。这与在林麝、鸡和大熊猫中的研究结果一致[15-17]。

研究发现，在貉、蓝狐(Alopexlagopus)和银狐(Vulpesvulpesfulva)的肠道菌群中，Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria均占据优势地位，3种菌门相对丰度比例相加均超过90%[2,20-21]。在本研究中，貉肠道菌群在门水平上同样以Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria为主，3种菌门相对丰度比例相加在雄貉和雌貉中均超过97%，其中Firmicutes和Bacteroidetes相对丰度比例相加均超过94%。

在本试验发现的6个优势菌属中，Streptococcus、Phascolarctobacterium、Lactobacillus和Blautia属于Firmicutes，Bacteroides和Alloprevotella属于Bacteroidetes。在蓝狐肠道菌群中，Streptococcus、Lactobacillus、Phascolarctobacterium、Bacteroides和Blautia也是优势菌属[22]。在日粮组成完全为各种肉类的狞猫(Caracalcaracal)及日粮组成主要为各种竹子的大熊猫的肠道菌群中，Streptococcus均为优势菌属[23-24]。在本试验中，饲粮中粗蛋白的比例为23.74%。此外，饲粮中含有大量的豆类和玉米粉，豆类、玉米和竹子中都含有大量的纤维素，这说明Streptococcus在蛋白质及纤维素代谢中发挥作用。在猪肠道菌群中Lactobacillus的数量与日粮中蛋白质的水平正相关[25-26]。在本试验及一项研究蓝狐肠道微生物的试验中，饲粮中粗蛋白质的比例分别为23.74%和30.24%，此外，蓝狐肠道菌群中Lactobacillus的比例为9.86%，高于本试验中的2.82%±2.23%(雄貉)和1.85%±1.38%(雌貉)，这进一步验证了Lactobacillus在蛋白质代谢中的作用。此外，在饲粮中添加可溶性玉米纤维、高粱和麦片会增加Firmicutes中另外2个优势菌属Phascolarctobacterium和Blautia的水平[27-28]。因此，本试验中，Firmicutes中的优势均属主要与纤维的发酵及碳水化合物的代谢相关。据报道Bacteroides主要降解蛋白质和脂肪[29]，本试验的饲粮组成中，粗蛋白质和粗脂肪的比例分别为23.74%和8.82%。Bacteroidetes中的另一优势菌属Alloprevotella主要产生琥珀酸和醋酸，能够改善肠道屏障发挥抗炎作用，是一种有益菌[30]。由此可见，黑貉肠道菌群的优势菌属与其饲粮组成密切相关，体现了日粮对肠道微生物深刻的影响。

用Unifrac weighted distance进行Pcoa分析，发现取自雌貉与取自雄貉的样品分离不显著，Adonis检验发现组间群落结构差异不显著(P>0.05)。这说明在本试验条件下，雌貉与雄貉肠道菌群的群落结构差异不显著。与此一致，雌貉与雄貉肠道菌群的各菌门和菌属在组间差异均不显著(P>0.05)。

根据PICRUST功能预测的结果，雌貉肠道菌群中脂质代谢、氨基酸代谢、信号传导、细胞运动、膜转运和环境适应等与雄貉相比显著上调(P<0.05)，而雄貉肠道菌群中碳水化合物代谢、能量代谢、辅酶因子和酶家族等功能显著上调(P<0.05)。这可能是由于冬毛期貉的采食量降低，雌貉肠道菌群具有更强的环境适应能力，可通过脂质与氨基酸代谢提供能量。在冬眠的棕熊中，肠道微生物代谢脂质的能力较夏季升高，通过脂质代谢在冬眠期间为机体提供能量。雄貉菌群中碳水化合物代谢、能量代谢及酶家族等功能较雌貉显著上调，这说明雄貉肠道菌群在冬毛期具有更强的从饲料中获取能量的能力。

本试验中，在饲养环境及饲粮组成相同的条件下，虽然雌貉肠道菌群的多样性和丰富度都高于雄貉，但是二者之间的菌群结构差异不显著。功能预测发现二者在碳水化合物代谢、能量代谢、脂质代谢和氨基酸代谢等方面差异显著，为后期雌性与雄性貉的精细化饲养提供数据支撑。此外，本试验中发现的优势菌属均与饲粮组成密切相关，进一步体现了日粮对肠道微生物深刻的影响作用。