基于PI3K/AKT/GSK-3β 信号通路探讨白芷乙素对胆汁淤积性肝炎小鼠的作用

胡旭中，黄宜锋，张伟

（深圳市龙华区人民医院，广东深圳 518109）

胆汁淤积症是一种由于胆汁形成或分泌障碍而引起的有毒胆汁酸潴留的临床综合征，多种肝病是由胆汁淤积所发展而来，包括原发性硬化性胆管炎、胆汁淤积性肝炎和原发性胆汁性肝硬化等[1]，其中胆汁淤积性肝炎在临床中较为常见。流行病学研究发现，我国慢性肝病住院患者胆汁淤积性肝炎的发生率高达10%以上[2]。胆汁淤积性肝炎病因复杂，其与病毒、细菌、寄生虫、药物和（或）毒物、酒精、自身免疫、肿瘤和遗传代谢等密切相关[3]。然而，临床上用于胆汁淤积性肝炎的治疗药物仍较为欠缺，病人预后较差。目前，熊去氧胆酸是FDA 唯一批准用于治疗胆汁淤积的药物，但其疗效仅限于原发性胆汁性肝硬化的早期阶段[4]。近些年来，针对胆汁淤积性肝炎治疗方法虽然取得的一定的进展，特别是越来越多的中药有效成分逐渐被发现对胆汁淤积性肝炎展现出良好的防治作用[5-6]，但目前寻找、开发具有高效低毒的抗胆汁淤积性肝炎新药仍是科研工作者的首要任务。

素有护肝降酶之王美誉的白芷，研究表明其对肝纤维化有较好的保护作用，但其具体的护肝有效成分尚不明确[7]。作为白芷主要活性成分之一的白芷乙素，其具备出色的抗炎、抗氧化以及抗凋亡等药理作用[8-9]。基于本课题组前期通过预实验初步针对白芷相关成分进行筛查，包括欧前胡素、氧化前胡素、白芷乙素等，结果表明白芷乙素可较好地改善胆汁淤积性肝炎小鼠的症状，主要参考黎明等[10]白芷乙素的给药剂量以及预实验结果，确定20 mg/kg为本实验的最优给药剂量。截至目前，尚未发现白芷乙素对胆汁淤积性肝炎防治方面的相关报道。本实验通过灌胃1%ANIT 橄榄油溶液建立小鼠胆汁淤积性肝炎模型，基于PI3K/AKT/GSK-3β信号通路探讨白芷乙素对胆汁淤积性肝炎小鼠的作用及其机制，为临床治疗胆汁淤积性肝炎新药开发提供部分实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要药物与试剂

白芷乙素购于上海经科化学科技有限公司（质量分数≥98%）；熊去氧胆酸胶囊购于德国Losan-Pharma GmbH（250 mg/粒，批号：15A10039L）；α-萘异硫氰酸酯（ANIT）购于上海源叶生物科技有限公司（质量分数≥98%）；橄榄油购于上海佳格食品有限公司；TNF-α和IL-1β检测试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，批号分别为20 190612；20 190824；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（T-BIL）、直接胆红素（D-BIL）、间接胆红素（I-BIL）、总胆汁酸（TBA）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）检测试剂盒购于南京建成生物有限公司，批号分别为20200914、20200522、20200616、20200612、20200706、20200825、202011023、20201105、20 200514；PI3K、AKT 和p-GSK-3β单克隆抗体购于abcam 公司，批号分别为MAB18743、MAB1386、DY524。

1.2 动物分组与给药

3月龄雄性C57BL/6小鼠32只，体质量18～22 g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物生产许可证号：SCⅩK（京）2019-0008。动物于SPF 环境中适应性喂养1周后，按体质量随机分组，分别为正常对照组（Control）、模型组（Model）、熊去氧胆酸组（ⅩQ，100 mg/kg）和白芷乙素组（BZ，20 mg/kg），每组8只。动物造模48 h后灌胃给药，连续给药7 d，正常对照组和模型组灌胃等量生理盐水。

1.3 小鼠胆汁淤积性肝炎模型建立

主要参照文献[11]方法构建小鼠胆汁淤积性肝炎模型，具体方法如下：小鼠禁食12 h（正常饮水），一次性灌胃给予1%ANIT 橄榄油溶液，按50 mg/kg体质量给药，诱发48 h，建立小鼠胆汁淤积性肝炎模型，正常对照组一次性灌胃给予等量橄榄油溶液。

1.4 肝组织病理学观察

实验结束后，小心切取肝右叶组织，浸泡于10%（φ）中性甲醛24 h，进行石蜡包埋和HE染色，具体步骤如下：切取同一部位肝组织约2 mm，流水浸泡过夜，分别用70%（φ）乙醇、95%乙醇、100%乙醇浸泡5 h，二甲苯透明2 min，石蜡浸泡1 h（60 ℃）后进行石蜡包埋、切片，其中切片厚度为4 μm。再按HE 试剂盒操作说明书步骤染色后，晾干、封片以及镜检。

1.5 血清肝功能酶、胆红素以及胆汁酸水平检测

实验结束后，2%戊巴比妥钠麻醉小鼠后，摘眼球取血，4 ℃放置2 h后，于4 ℃离心机中按3 500 r/min，离心15 min，分离血清，按照测试盒说明书操作步骤检测血清ALT、AST、ALP、T-BIL、D-BIL、I-BIL 和TBA水平。

1.6 肝组织炎症因子与氧化应激指标检测

使用玻璃匀浆器，4 ℃环境中，取适量肝组织，制备10%肝组织匀浆，并4 ℃，3 500 r/min的转速离心15 min，取上清。按照ELISA 检测试盒说明书操作步骤检测肝组织匀浆中TNF-α、IL-1β、MDA 水平以及SOD活性。

1.7 肝组织PI3K/AKT/GSK-3β 信号通路相关蛋白表达水平检测

聚丙烯酰胺凝胶电泳中每孔统一上样为50 μg，常规电泳分离蛋白和转PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，4 ℃孵育一抗过夜（PI3K、AKT 和p-GSK-3β、β-actin 均按1∶2 000 稀释），二抗室温孵育1 h，PBST洗膜3次，10 min/次，显影剂浸泡后，使用凝胶成像系统成像曝光、拍照。

1.8 统计学方法

使用SPSS 19.0 软件对实验数据进行统计学分析。计量资料以表示，采用单因素方差分析和LSD 检验对多组间均数进行比较，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 白芷乙素对胆汁淤积性肝炎小鼠肝组织病理学的影响

正常对照组肝组织整体结构正常，胆囊呈淡黄色，未见肿大（图1-A1），肝细胞结构正常、清晰，无异常（图1-A2）；模型组可见肝组织肿大，呈淡黄色，胆囊肿大，呈褐色（图1-B1），有大量炎性细胞浸润，并有明显的肝细胞坏死区域（图1-B2）。白芷乙素组（图1-C1、C2）和熊去氧胆酸组（图1-D1、D2）上述症状明显改善，胆囊肿大程度减轻（图1-A3、A4），炎性细胞浸润数明显减少，肝细胞坏死区域明显减轻，未见明显的成纤维细胞增生。

图1 各组小鼠肝组织病理学变化（HE染色，100×）Figure 1 Hepatic histopathological changes of mice in each group

2.2 白芷乙素对胆汁淤积性肝炎小鼠血清肝功能酶的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠血清肝功能酶ALT、AST 和ALP 水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，白芷乙素组和熊去氧胆酸组血清肝功能酶ALT、AST和ALP水平明显降低（P＜0.01），见图2。

图2 各组小鼠血清ALT、AST和ALP水平Figure 2 Levels of ALT,AST and ALP in serum of mice in each group(,n=8)

2.3 白芷乙素对胆汁淤积性肝炎小鼠胆红素和胆汁酸水平的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠血清T-BIL、D-BIL、I-BIL和TBA水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，白芷乙素组和熊去氧胆酸组血清T-BIL、D-BIL、I-BIL和TBA水平明显降低（P＜0.01），见图3。

图3 各组小鼠血清T-BIL、D-BIL、I-BIL和TBA水平Figure 3 Levels of T-BIL，D-BIL，I-BIL and TBA in serum of mice in each group(,n=8)

2.4 白芷乙素对胆汁淤积性肝炎小鼠肝组织炎症因子TNF-α和IL-1β水平的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织炎症因子TNF-α和IL-1β水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，白芷乙素组和熊去氧胆酸组肝组织炎症因子TNF-α和IL-1β水平明显降低（P＜0.01），见图4。

图4 各组小鼠肝组织TNF-α和IL-1β水平Figure 4 Levels of TNF-α and IL-1β in liver tissue of mice in each group(,n=8)

2.5 白芷乙素对胆汁淤积性肝炎小鼠肝组织氧化应激指标SOD活性和MDA水平的影响

与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织氧化应激指标SOD 活性明显降低（P＜0.01），MDA 水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，白芷乙素组和熊去氧胆酸组肝组织氧化应激指标SOD 活性明显升高（P＜0.01），MDA水平明显降低（P＜0.01），见图5。

图5 各组小鼠肝组织SOD活性和MDA水平Figure 5 Activity of SOD and levels of MDA in liver tissues of mice in each group(,n=8)

2.6 白芷乙素对胆汁淤积性肝炎小鼠肝组织PI3K/AKT/GSK-3β信号通路相关蛋白表达水平的影响

与正常对照组比较，模型组肝组织的PI3K 和AKT 的蛋白表达量明显升高（P＜0.01），而p-GSK-3β的蛋白表达量明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，白芷乙素组和熊去氧胆酸组肝组织的PI3K 和AKT 的蛋白表达量明显降低（P＜0.01），而p-GSK-3β的蛋白表达量明显升高（P＜0.01），见图6。

图6 各组小鼠肝组织PI3K、AKT和p-GSK-3β蛋白表达水平Figure 6 Expression levels of PI3K，AKT and p-GSK-3β protein in liver tissues of mice in each group(,n=3)

3 讨论

胆汁淤积性肝炎好发于男青年，发病较为隐匿，早期症状不明显，临床表现特异性低，容易引起漏诊和误诊，从而延误病情。胆汁淤积性肝炎常可引起肝内胆管堵塞，最终导致肝硬化，甚至肝衰竭。通过一次性灌胃给予1%ANIT 橄榄油溶液建立的小鼠胆汁淤积性肝炎模型是一种胆汁淤积性肝病的成熟模型，多用于动物胆汁淤积性肝病的药效及机制研究[12]。熊去氧胆酸是FDA 唯一批准用于治疗胆汁淤积的药物，故本研究选用一次性灌胃给予1%ANIT橄榄油溶液建立的小鼠胆汁淤积性肝炎模型，以熊去氧胆酸为阳性对照药，探讨白芷乙素对小鼠胆汁淤积性肝炎的药效及机制。

血清肝功能酶、胆红素以及胆汁酸是临床上评价肝胆功能异常常用的检测指标[13]。本研究发现，白芷乙素和熊去氧胆酸均能明显降低血清ALT、AST、ALP、T-BIL、D-BIL、I-BIL 和TBA 的水平，提示白芷乙素和熊去氧胆酸可能通过改善胆汁淤积性肝炎小鼠的肝胆功能，从而减轻胆汁淤积性肝炎的症状。同时肝组织病理学观察发现白芷乙素和熊去氧胆酸可减轻胆囊肿大程度和炎性细胞浸润程度，减少肝细胞坏死区域。炎症和氧化损伤是胆汁淤积性肝炎2 个重要的发病机理[14-15]。本研究发现，白芷乙素和熊去氧胆酸可明显降低肝组织TNFα、IL-1β和MDA 水平，明显升高SOD 活性，提示白芷乙素和熊去氧胆酸可通过抗炎和抗氧化作用，抑制胆汁淤积性肝炎的发生发展。PI3K/AKT/GSK-3β信号通路是人体细胞内较为重要的信号通路之一，与细胞生长、分化、代谢和凋亡等生物过程密切相关[16-17]。PI3K 作为细胞内重要的信号转导分子，被激活后，可活化下游因子AKT。AKT磷酸化下游因子GSK-3β上的丝氨酸残基，p-GSK-3β抑制了细胞色素C 的释放和Caspase-3的活性，从而抑制肝细胞的凋亡过程[18]。本研究发现，白芷乙素和熊去氧胆酸可明显下调肝组织PI3K 和AKT 的蛋白表达量，而上调p-GSK-3β的蛋白表达量，提示白芷乙素和熊去氧胆酸可通过调节PI3K/AKT/GSK-3β信号通路，抑制胆汁淤积性肝炎所致的肝细胞凋亡。

综上所述，白芷乙素对胆汁淤积性肝炎小鼠具有较好的保护作用，其机制可能与抗炎、抗氧化应激损伤以及调节PI3K/AKT/GSK-3β信号通路有关。