男性不育和性发育异常病例中27个序列标签位点的应用价值

王红丹，李永乐，汪济海，苏俊祥，冯战启

1)郑州大学人民医院；河南省人民医院医学遗传研究所 郑州 450003 2)国家卫生健康委员会出生缺陷预防重点实验室；河南省人口缺陷干预技术研究重点实验室；河南省生殖健康科学技术研究院 郑州 450014 3)郑州大学第一附属医院骨科 郑州 450052 4)郑州市第一人民医院泌尿外科 郑州 450004

Y染色体无精子症因子(azoospermia factor,AZF)微缺失是指Y染色体长臂上AZF区域发生微小的DNA片段缺失[1],是造成不育的重要遗传因素。性发育异常在不孕不育患者中占有相当大的比例，最常见的性发育异常类型是克氏综合征[2-3]。因此，针对不育和性发育异常患者，不仅仅要关注AZF的微缺失，更要关注性染色体异常的发生。本研究采用27个序列标签位点(sequence tagged site,STS)，运用复合荧光多重PCR-毛细管电泳DNA片段分析技术对AZF微缺失与性染色体倍型进行联合检测，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2019年10月至2020年8月到河南省人民医院就诊的不育、性发育异常、性功能异常、尿道下裂、两性畸形等或超声提示胎儿生殖器官发育异常的91例患者，其中社会性别为女性5例，社会性别为男性85例，胎儿1例(孕25周)。

1.2 样本采集及DNA提取抽取90例患者外周静脉血2 mL，EDTA抗凝；抽取胎儿羊水10 mL。采用柱式DNA提取试剂盒(上海生物工程有限公司)，按照说明书进行DNA提取操作。使用Qubit 3.0(美国Invitrogen公司)进行DNA样本浓度的检测。将DNA浓度调整至50 mg/L，4 ℃保存备用。

1.3 AZF微缺失的琼脂糖凝胶电泳检测针对Y染色体是否发生AZF微缺失，共检测15个STS(亚能生物技术深圳有限公司)。其中，6个STS是欧洲男科协会(European Academy of Andrology,EAA)/欧洲分子遗传质量协作网(European Molecular Genetics Quality Network,EMQN)于1999年和2004年提出建议采用的必检位点：AZFa区(sY84和sY86)，AZFb区(sY127和sY134)以及AZFc区(sY254和sY255)。8个STS用于确认是否整段完全缺失：AZFa区(sY82、sY1064、sY1065和sY88)以及AZFb区(sY105、sY121、sY1192和sY153)。1个为异染色体标签(sY160)。按照说明书进行琼脂糖凝胶电泳操作。

1.4 AZF微缺失与性染色体倍型拓展检测采用27个STS，运用复合荧光多重PCR-毛细管电泳DNA片段分析技术对AZF微缺失与性染色体倍型拓展进行检测，试剂购自上海精准生物医药有限公司，具体检测区域和扩增位点见表1。

表1 27个STS的名称及功能说明

1.5 G显带染色体核型分析对于27个STS检测结果显示性染色体异常的患者，抽取其静脉血5 mL，肝素抗凝，4 ℃保存。血液接种于RPMI 1640培养基中培养，常规制片染色，镜检30个分裂象，分析患者的染色体核型。

1.6 比较基因组杂交芯片(array comparative genomic hybrization，aCGH)分析对于27个STS检测结果显示性染色体存在嵌合的患者，在染色体核型分析的同时进行aCGH分析。采用美国Agilent array平台、SurePrint G3 Human CGH Microarray 8×60K芯片对全基因组进行检测，分辨率为200 kb。

2 结果

2.1 AZF微缺失检测结果85例社会性别男性患者中，检见9例AZF微缺失(AZFa、AZFb和AZFc区全缺失3例，AZFc区不全缺失5例，AZFb区不全缺失1例)。5例社会性别为女性的患者中，除1例AZFa、AZFb和AZFc区不存在微缺失，其余4例检测区域全缺失;1例疑似外生殖器异常的胎儿未检见AZF微缺失。总体异常检出率为11.0%(10/91)。

2.2 AZF微缺失与性染色体倍型拓展检测结果以及特殊病例检测峰图9例AZF微缺失的社会性别男性患者中，此种方法检测出同样的缺失，不同的是，1例不全缺失患者本检测方法检见了合并性染色体异常，2例全缺患者检见合并性染色体异常；检见12例患者性染色体存在异常。5例社会性别为女性的患者中，检见1例患者AZFa、AZFb和AZFc区不存在缺失(和琼脂糖凝胶电泳检测结果相同)且提示性染色体异常，1例患者存在性染色体异常。1例胎儿存在性染色体异常，推测可能存在性染色体嵌合可能。性染色体异常检出率为19.8%(18/91)，总体异常检出率为26.4%(24/91)。18个性染色体异常患者检测结果及临床诊断见表2。1号样本和3号样本检测发现都存在Y染色体片段[以1号样本为例，检测峰图见图1(A)]；样本18检测发现可能存在性染色体嵌合，检测峰图见图1(B)。

2.3 染色体核型分析结果对提示性染色体异常的患者进行染色体核型分析，结果显示，47,XXY患者10例，女性性反转3例，男性性反转1例，48,XXYY患者1例，47,XY,i(X)(q10)患者1例，45,X患者1例，45,X[20]/46,XY[10]胎儿1例。18号胎儿样本结果与27个遗传标记检测结果相互印证。1号样本没有阳性发现。结果见表2。

表2 18个性染色体异常患者性染色体倍型检测结果、染色体核型分析结果及临床诊断

A：1号样本检见AZF全段缺失，且提示X染色体存在两条；B：18号样本未检见AZF微缺失，但提示性染色体可存在嵌合，Y染色体可能有片段留存图1 1号样本与18号样本27个STS检测结果

2.4 特殊病例aCGH分析验证结果为了进一步验证1号和18号样本的检测结果，我们对这两个样本进行了aCGH检测。1号样本检测结果为arr[hg19](X)×2,Yp11.31p11.2(2654831-8875193)×1，Y染色体留存区域大小为6.22 Mb，拷贝数为1。18号样本检测结果为arr(X)×1,(Y)×0～1。aCGH核型图见图2。aCGH检测结果与27个遗传标记检测结果相互印证。

A：1号样本aCGH检测结果显示，与正常女性相比存在Y染色体片段拷贝数增加；B：18号样本aCGH检测结果显示，与正常男性相比，Y染色体拷贝数减少图2 1号样本与18号样本aCGH核型图

3 讨论

Y染色体AZF微缺失是男性精子生成障碍的常见原因，是导致男性不育的重要因素。不同地区、不同种族的男性不育人群中AZF微缺失比例为3.0%～55.0%[4]，中国人群AZF微缺失率在不育人群中为14.8%[5]。2004年EAA/EMQN关于Y染色体微缺失分子诊断最佳实践指南以及中国男科协会均已将Y染色体AZF检测推荐为无精、严重少精症患者确诊以及辅助生殖前的必检项目。

染色体异常是引起男性不育的重要因素之一，约6.0%的男性生精异常是由染色体异常导致[6]，其中性染色体异常约占1/3[7]。克氏综合征仍然是目前男性无精症的第一遗传因素[8]。性染色体异常包括性染色体数目异常、结构异常、性反转以及性染色体嵌合等，是性发育异常的常见因素[9]，可导致第二性征发育不全、性器官发育异常、原发或继发闭经、两性畸形以及不孕不育等。因此如果对AZF和性染色体数目等异常进行同时检测，无疑将大大提高异常检出率，能更好地指导临床诊疗。本研究仅对AZF进行检测，总体异常检出率为11.0%，应用27个STS检测系统进行检测后，总体异常检出率为26.4%，检出率提高了近3倍。本检测系统性染色体异常检出率为19.8%。因此对AZF微缺失和性染色体数目等异常进行同时检测非常有意义。以往常用的检测系统主要是EAA/EMQN推荐的6个AZF区必检位点，有的实验室增加到15个STS位点，但也都是分布于AZF区；而本检测系统除了增加AZF区检测位点，实现AZF6个必检位点与9个扩大筛查位点的联合检验外，还增加了性染色体倍型检测位点，一次检测除了可以检出AZF微缺失，还可以覆盖克氏综合征等性染色体倍型异常病例，大大提高了异常病例检出率。

目前临床实验室多采用AZF区15个STS位点对AZF微缺失进行检测[10-11]。本研究对传统检测位点进行拓展，同时检测27个遗传标记，采用复合荧光多重PCR-毛细管电泳DNA片段分析技术，依据片段的有无来确定AZF区是否缺失，依据峰型和相对荧光强度对X染色体和Y染色体的倍型进行判断。本研究结果显示，该检测系统对本研究对象中的克氏综合征等性染色体数目异常及性反转均可检出，对于性染色体大片段结构异常以及性染色体嵌合也有很好的提示作用。该检测体系运用多重PCR结合毛细管电泳的方法，检测方法不仅简单、经济，而且可靠。但是需要提出的是，由于遗传标记选择的数目局限性，如果异常片段不包括本研究所选择的遗传标记片段，那么就有漏诊的风险；因此在临床中，对于阴性结果，需要结合患者临床表型，进而决定是否进行更进一步的检测，比如染色体核型分析、aCGH检测及基因检测等[12]。