玉米淀粉调控的研究进展

杜 明，方 玉,2，李潜龙，康云海，王 慧,2，张从合,2

（1上海中科荃银分子育种技术有限公司，上海 200030；2安徽荃银高科种业股份有限公司，合肥 230088）

0 引言

玉米(Zea mays L.)是中国第一大粮食作物，同时也是重要的工业原料和饲料原料的主要来源[1]。近年来，随着国民生产总值以及人民生活水平质量的提高，玉米的产量已经不是生产中的限制因素，相反，玉米的品质成为现代玉米育种工作者的重点。因此改善玉米的品质性状对于玉米产业以及国民经济的发展具有重要的意义。淀粉作为和谷类作物种子的主要储存形式，玉米胚乳中贮藏的淀粉占整个世界淀粉市场的90%以上[2]，研究表明，玉米籽粒的增重过程主要是淀粉合成和积累的过程，通过不断改良玉米淀粉的含量从而可以实现“以质增重”[3]。

长期以来，玉米科研工作者通过分子生物学方法和转录组测序手段发现了大量调节玉米淀粉合成和代谢的转录因子，因其对植物的生理生化反应以及生长有重要的作用而被广泛研究[4]，其中很多调控因子的功能近年来也陆续得到证明。如抑制玉米ZmZHOUP1的表达可以导致籽粒发育的异常[5]；SUSIBA2，属于WRKY转录因子家族，能够与淀粉合成基因的启动子结合，从而参与淀粉的合成[6]；有研究表明淀粉合成关键酶可以和其他蛋白相互作用从而以蛋白异聚体的形式调控淀粉的合成[7]，但是，关于玉米淀粉在蛋白水平上的研究较少。玉米中，ISA1和非催化功能ISA2形成异聚复合物或者仅含有ISA1的同聚复合物来参与淀粉的合成[8]。本研究列出了相关酶，进一步澄清了淀粉合成代谢的调控网络，调控淀粉代谢的转录因子和顺式作用元件的系统表征为玉米品质的遗传改良提供依据。

1 玉米淀粉结构

淀粉根据其连接方式可以分为直链淀粉和支链淀粉，直链淀粉和支链淀粉的组成、比值决定着玉米籽粒的品质[9]，以D-吡喃葡萄糖为单位连接形成。直链淀粉是由α-1,4-糖苷键连接而成的，相对分子质量大约为3万～16万，由300～1200个葡萄糖残基构成。直链淀粉在其分子的一端为非还原末端基，另一端为还原末端基，聚合度大约为100～6000。直链淀粉的通过其内部的氢键相互作用，使其以卷曲螺旋的形式存在，每圈包括6个葡萄糖单元[10]。当碘液与直链淀粉相接触时，碘分子进入淀粉分子内部的螺旋内部，平均每圈螺旋可以束缚一个碘分子，直链淀粉可以束缚很多的碘分子，因此直链淀粉的与碘显色呈现深蓝色[11]。支链淀粉的组成既含有α-1,4-糖苷键，也含有α-1,6-糖苷键，相对分子质量要大于直链淀粉，分子质量大约为10万～100万，α-1,6-糖苷键连接的分支上有许多形如树枝状的分支[12,13]。支链淀粉分子具有一个还原末端基和许多非还原末端基，聚合度大约为1000～300万。支链淀粉虽然也可以形成螺旋卷曲，但是其每个分枝较短，与碘分子形成络合物的数目较少，因此，支链淀粉与碘的显色呈现紫红色或红色[14]。

2 玉米淀粉的生物合成

淀粉合成的场所为叶绿体和淀粉体，其生物合成需要一系列酶（AGPase、SS、SBE、DBE）的参与和调控。

白天临时性淀粉在叶片中合成积累，夜间进行降解供植株进行生理代谢，其颗粒淀粉几乎全部为支链淀粉，体积较小[15-16]。在叶绿体中，通过卡尔文循环固定的CO2，经过一系列的化学反应最终形成1-磷酸葡萄糖，随后在ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的作用下形成ADPG，ADPG是淀粉合成的前体物质，在淀粉合成酶和淀粉分支酶的作用下合成直连淀粉和支链淀粉[17-18]。

在淀粉体中，以蔗糖作为合成淀粉的碳源，经过水解后的蔗糖以磷酸葡萄糖的形式进入淀粉体参与淀粉的合成。目前，有超过30个基因参与玉米淀粉的合成[19]，且编码这些关键酶的主效基因和功能已经比较明确。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶作为一种速效酶，是由两个大小相似的异源四聚体组成[20]。AGPase突变体中，其活性下降了90%～95%，且淀粉含量只有野生型玉米的25%～30%[21-22]。淀粉合成酶(SS)是一种葡萄糖转移酶，主要包括游离态的淀粉粒合成酶(SSS)和束缚态淀粉粒合成酶(GBSS)[23]，其中，GBSSⅠ与淀粉颗粒紧密地结合，GBSSⅠ与直连淀粉的合成相关，GBSSⅡ主要存在于非贮藏组织中，与支链淀粉的合成有关[23]。SSⅣ对支链淀粉结构作用较小，对淀粉粒的形成及颗粒形态起作用[25]。研究表明ZmEREB156可以和ZmSSⅢa的启动子结合，利用糖和ABA的协同作用正向调控淀粉的生物合成[26]。玉米中，wx突变体中则不含直连淀粉[27]。淀粉分支酶(SBE)具有双重的作用，一方面可以切开α-1,4糖苷键连接的葡聚糖,另一方面又能把切开的短链通过α-1,6糖苷键连接于受体链上。其中，SBEⅡa和SBEⅡb氨基酸序列的同源性达到80%[28]，在SBE突变体中，在SBEⅡb失去其活性的前提下SBEⅡa才会发生支链淀粉结构的改变，sbe1或者SBEⅡa其中一个发生突变并不会改变胚乳淀粉的链长分布[29]。淀粉去分支酶(SDBE)能消除支链淀粉中出现的异常支链分支，从而形成正常的分支[30]。在玉米突变体ZmPUL中，其在白天合成和在夜间分解能量的速率是低于野生型的，进一步表明PUL与生物代谢和淀粉的合成有关[31]。

3 淀粉合成相关基因在玉米各个组织中的表达

目前，通过转录组测序手段，研究者们已经筛选并且解析了大量调控玉米淀粉合成的相关基因[32]。利用TBtools软件对近年来发表的一些基因构建热图分析，大部分的基因在玉米胚乳中有较高的表达或者只在玉米胚乳中表达，少数在叶片中表达，这与淀粉的合成场所刚好相对应。

4 相关转录因子家族基因在淀粉合成中的作用

4.1 DOF家族转录因子

对于玉米DOF家族中，DOF蛋白是植物特有的一类转录因子，含有锌指结构。据报道，DOF蛋白在植物的发育过程中可以作为转录激活剂或者抑制剂，可以结合AAAG顺势作用元件[33-35]。在玉米ZmDOF36中，ZmDOF36可以与ZmAGPL1、ZmAGPS1a、ZmSSⅡa、ZmGBSSⅠ、ZmISA1以及ZmPUL中的AAAG序列特异性结合，这6个基因参与了淀粉的合成[36]。ZmDOF1可以与C4磷酸烯醇丙酮酸盐基因的启动子相互作用，从而增强启动子的活性。ZmDOF2是一种抑制剂抑制转录[37]。ZmDOF3可以识别和结合NKd1启动子中的AAAG序列，对正向调节胚乳中淀粉的合成[38]。

4.2 NAC家族转录因子

NAC转录因子作为植物特有的一类转录因子，在其N端包括A、B、C、D、E 5个结构域，是NAC转录因子的结合区域，由160个氨基酸残基组成[39]。ZmNAC34是淀粉重要的调节剂，ZmNAC34可以识别结合下游基因启动子的CATGTG序列，同时其过表达可以降低籽粒中的总淀粉含量，而总淀粉含量增加[40]。ZmNAC128和ZmNAC130可以通过一个常见的DNA结合位点ACGCAA直接激活Bt2，从而影响Bt2的转录，从而降低其蛋白含量，最终导致淀粉合成受阻[41]。ZmNAC36可以增加5个淀粉合成基因的转录水平[42]。

4.3 MYB家族转录因子

MYB类转录因子广泛存在于真核生物中，在其氨基酸末端存在高度保守的DNA结合结构域。根据保守结构域中串联重复序列的数目分为四类：1R-、R2R3-、3R-和4R-MYB[43]。据报道，R2R3-MYB蛋白参与植物组织发育等多种生物学功能。ZmMYB14是典型的R2R3-MYB类转录因子，ZmBT1属于线粒体载体蛋白家族(MCF)大类[44]，在胚乳中特异性表达，在-176 bp到-168 bp处含有MBSI位点(TAACTG)，ZmMYB14可以与TAACTG序列结合，从而增强ZmGBSSⅠ、ZmSSⅠ、ZmSSⅡa、ZmSBE1、ZmISA1和ZmISA2启动子的活性，同时，ZmMYB14是玉米ZmBT1的关键调节因子，与淀粉的生物合成密切相关[45-46]。

4.4 bZIP家族转录因子

bZIP家族蛋白可以分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、S共10个亚族[47]。蛋白可以识别的ACGT序列，包括G-box(CACGTG)、C-box(GACGTC)和A-box(TACGA)序列。bZIP家族转录因子ZmbZIP91可以直接与淀粉合成基因ZmAGPs1、ZmSS1、ZmISA1启动子中的ACTCAT序列结合，进而调节叶片中淀粉的合成[48]。ZmbZIP22可以与淀粉合成基因ZmAGPL1、ZmAGPS1a、ZmGBSSⅠa、ZmSSⅠa、ZmSSⅢa、ZmISA1、ZmISA2、ZmBEⅡa启动子中的ACGT序列结合，同时，ZmbZIP22基因的过表达导致玉米籽粒中的总淀粉、直连淀粉和支链淀粉的含量下降，ZmbZIP22负向调控淀粉的合成[49]。近年来研究较多的Opaque-2也是属于bZIP家族，研究表明，玉米突变体中O2可以结合ZmSSⅢ启动子中的O2-box以调节淀粉合成，PBF可以在ZmSSⅢ启动子的O2-box附近结合P-box的核心元件并与O2共同调解淀粉合成基因的表达，同时PBF和O2可以间接调节ZmSSⅡa和ZmSBE1，最终导致淀粉含量的下降[49]。

4.5 MADS-BOX家族转录因子

在植物中，MADS-BOX有两种类型，ZmMADS1a作为一种典型的MADS-BOX家族转录因子，属于MIKCc二类。在过表达玉米中，通过对16个调节玉米淀粉合成与代谢的基因的表达量分析，结果表明ZmMADS1a基因广泛参与玉米胚乳中淀粉和葡萄糖代谢的调控，对淀粉含量进行分析，总淀粉、直连淀粉和支链淀粉的含量都是显著上升的[51]。异源过表达水稻中ZmES22可以与OsGIF1的启动子序列CAGGT序列结合，对淀粉合成通路中17个基因表达量分析，除了OsISA2、OsSSⅠ和OsPUL，大多数基因的表达量都是下调，对其淀粉含量进行分析，发现其总淀粉和直连淀粉的含量显著下降，ZmES22负向调控水稻胚乳中淀粉的合成[52]。

4.6 AP2/EREB家族转录因子

AP2/EREB蛋白至少包含一个DNA结合结构域，AP2/EREB分为3个独立的家族：ERF、AP2、RAV。过表达玉米中，ZmEREB156可以增强Zmsh2和ZmSSⅢa的启动子活性，同时ZmEREb156可以与ZmSSⅢa的启动子结合，不能与Zmsh2的启动子结合。此外，ZmEREB156通过和ABA的协同效应，正向调节淀粉生物合成基因ZmSSⅢa[26]。ZmEREB94有较强的转录活性，可以直接与ZmSSⅠ的启动子结合，同时也可以间接调节Zmsh2和ZmGBSSⅠ的表达[53]。

4.7 其他

OPAQUE11作为一种bHLH型转录因子，可以直接调控胚乳发育和营养代谢，同时，也直接调节cyPPDK（胞质型丙酮酸磷酸双激酶）和多种碳水化合物的代谢，在突变体中对其淀粉含量进行分析，发现其淀粉含量显著下降[54]。

据报道，在24个玉米淀粉合成基因中，有15个基因主要在胚乳中表达。研究表明，对玉米胚乳采用ABA处理后发现其可以抑制淀粉基因的表达，特别是ZmAGPS2和ZmSSⅢa；IAA同样可以抑制淀粉基因的表达，ZmSSⅢa除外；而蔗糖可以上调15个在玉米胚乳中表达的淀粉基因。通过蔗糖和ABA结合诱导处理胚乳，发现大多数淀粉基因的表达水平是对照的2倍；而蔗糖和IAA结合诱导中，虽然表达水平受到抑制，但是大多数淀粉基因的表达都是高于对照组[55]。

5 结论

通过对不同家族的转录因子的研究，发现大量的转录因子都是通过与淀粉通路中的合成基因的启动子结合或者是影响启动子的活性来调节淀粉的生物合成（图2），转录因子也可以通过影响一些基因的表达来间接影响淀粉的含量（图3）。

图2 叶片和胚乳中淀粉代谢的调节因子

图3 植物淀粉调节网络

6 问题与展望

近年来，研究者通过各种手段和方法得到了大量与淀粉合成直接或者间接相关的基因。第一，利用转录组分析和GWAS挖掘，通过筛选解析获得大量调控玉米淀粉合成的相关基因，第二，通过已知发表的其他物种（如水稻、拟南芥）的基因来寻找玉米中的同源基因，进一步验证其是否参与淀粉的合成与代谢。第三，利用EMS诱变技术获得大量突变体库，通过观察籽粒大小相关的突变体或者筛选胚乳相关的突变体得到起作用的基因。第四，利用酵母双杂技术来筛选与淀粉酶互作的基因，通过进一步的验证进一步获得与淀粉合成代谢相关的基因。目前，这些手段虽然比较成熟，同时，得到的淀粉合成相关基因大量为转录因子，虽然这些转录因子的功能被后续证明，但是这些转录因子之间是否存在一定的联系上不清楚。此外，研究者虽然发现淀粉合成关键酶多和其他蛋白相互作用从而以蛋白异聚体的形式来调控淀粉的合成，但是对于淀粉合成在蛋白水平上的调控机制尚不清楚，与淀粉合成关键酶的直接互作或间接互作调控蛋白还知之甚少。

随着分子生物学和基因工程的发展，推测玉米淀粉的发展方向（1）通过筛选胚乳中特异性表达或者高表达的基因，通过突变其中的基因来研究其在淀粉合成中的功能；（2）既然淀粉合成通路中的相关酶的作用已经得到验证，因此可以通过共表达模式分析，找到与其表达模式一致的基因，然后进一步研究其功能；（3）目前对蛋白水平上的研究较少，因此可以通过酵母文库筛选与淀粉合成相关酶互作的基因研究其功能，此项工作应该是未来玉米淀粉研究的重点。