植物组织培养中常见病原菌种类及污染控制措施

谭鹏鹏，尚杨娟，朱凯凯，彭方仁

（南京林业大学林学院/南方现代林业协同创新中心，江苏南京 210037）

植物组织培养的过程主要是在无菌条件下进行，依靠其细胞的特点，将植物器官的根、茎、叶和种子以及相关植物细胞组织，比如花药组织、胚乳和皮层多个组织、体细胞这些原生质体应用在培养基上，运营无菌操作来对植物外植体进行接种，在适当的培养环境和条件之下，通过人工控制和配置来对植物生长的环境进行一个实体模拟，这是现代化离体培养技术，能够有效促进植物生长为完整的植株。目前，随着社会的进步和科技的快速发展，在植物组织培养方面的研究也在不断深入，种质保存和植物繁衍等多个方面都需要植物组织培养技术的融入，植物组织培养技术包含了植物材料接种以及培养物的转移等，多个操作环节的前提都要在无菌环境下开展。为了有效防控植物组织培养出现的污染现象，要创造良好的无菌条件，更好地控制操作持续时间的长短，提升工作效率。

1 植物组织培养中常见的污染源

1.1 自身污染源

植物组织培养中的污染是在植物组织培养过程中因培养材料自身问题和外界影响因素侵染而造成的污染。植物组织培养的材料均来源于田间，主要分为地上部和地下部2种，这种材料自身就带有病菌，因此在取材时一定要注意大气及材料表面的病菌，它可以从植物伤口和本身特有的入侵机制，直接对植物内部造成污染。

1.2 真菌污染源

真菌一般处于温度较高以及室内潮湿的环境，如果在植物组织培养中有真菌污染的情况，其会表现出毛绒状和絮状菌斑，还会有不同颜色的孢子出现。真菌污染能够在植物材料接种2～3d 中发现，其明显的特征在于产生面积较广的菌落，同时还会形成多种颜色的绒毛状菌斑，且带有霉味。真菌污染都是在植物组织培养接种阶段因其环境问题而形成的污染，在实际操作中普遍出现的真菌污染主要有青霉菌、黑曲霉菌和酵母菌等[1]。

1.3 病毒污染源

病毒污染出现的几率较小，其主要是以颗粒的形式呈现，病毒自身体积小。植物组织培养的过程中，病毒的污染无法通过肉眼观察，只有使用电子显微镜才能对病毒进行直观的观察。其会出现在细胞内部，但它自身不会对细胞造成伤害，处于潜伏状态。之所以在植物组织培养中会出现病毒污染，最重要的一点是它来源于外植体。

1.4 细菌污染源

细菌是庞大的微生物群体，它不仅存在植物组织培养中，日常环境当中也有细菌，例如水源、空气这些自然环境里都有大量的细菌，细菌的种类也有很多，它们大小不同，形态也不同。在植物组织培养中产生的细菌污染来源于植物材料表面又或是培养基表面，其性状主要以黏液状物体、浑浊水迹状以及泡沫发酵状等多种形态表现。在一般情况下，植物材料接种后1～2d 就可以观察到细菌污染。

2 病原菌种类的污染

2.1 病毒类

病毒只含有DNA 遗传因子，但病毒自身能够在细胞内寄生，同时还能在细胞外通过大分子颗粒状态所呈现。病毒类是病原菌的一大种类，其污染可以通过接种材料本身的病毒与自身核酸相结合，到宿主基因中，就可以引发潜伏性感染。这种类型的污染对于DAN 同源性研究能够提供相关依据。

2.2 真菌类

真菌的分布较为广泛，真菌自身的生长特点在于黑暗和潮湿的环境中，能够在富含有机物质的环境中生存。而在植物组织培养的过程，真菌的污染情况频繁出现，污染情况也较为严重。这是由于真菌自身能够产生孢子，其能够随空气飘散在环境中，跟随环境的变化，孢子能够逐渐形成为一个菌落，从而对整个培养基造成大面积污染。真菌类污染需要通过高清显微镜才能够观察到，随着科技的发展，现在通过使用DNA探针分析也能够观察到是否有真菌类污染的情况。

2.3 细菌类

细菌类自身特点较为简单，但种类繁多是它本身的一大特性，这种病原菌的结构主要由水生性较强单细胞原核微生物构成，能够大量地聚集在人体内外部以及日常环境的周围。接种的过程中，一定要注意对相关工具进行消毒，否则会导致接种人员因接触材料器皿而造成细菌性污染。这种污染情况在培养材料呈现黏液和混浊的水迹，而且还会出现发酵状泡沫塑料，产生臭味[2]。

3 植物组织培养中污染控制措施

3.1 设备消毒

要做好污染防控，就必须对接种室和培养室的实验工具及相关设施进行消毒，对无菌操作台要使用紫外灯照射30 min，用酒精清洁操作台，仔细地擦拭每一个部位，做到全面消毒。相关的器具也要注意更新换代，操作台上不要堆放物品。定期对操作台进行清洁消毒，测试其使用效果，定期进行检查和校正器具是否能够正常使用。如果灭菌器具没有合理地进行清洁，就会影响到植物组织培养结果。对于设备的消毒工作，一定要严格执行，并做到细致化操作[4]。

3.2 人员卫生控制

相关工作人员一定要注意植物组织培养操作环境的卫生，进入无菌环境之前，要在清洁好手部后才穿工作服，衣服穿好后也要再此对手部进行消毒，然后进入工作环境，这样可以有效减少外植体受污染的概率。在工作期间要勤洗手，注意个人卫生。在实际操作中，要严格要求自己，不佩戴首饰，不吸烟、不饮食，工作服不穿出无菌环境。更要对自己的更衣室进行消毒，定期清洁卫生。

3.3 科学合理选取外植体

外植体很容易出现污染，要从其源头采取污染防控的方式，在选取外植体时，一定要合理化、科学化的选择。不同的环境中，外植体所含有的细菌是不同的，面对这种情况，都是以脱毒植物采用分生组织来对其培养，能够有效减少污染率。同时要注意控制好选取外植体的时间，最好在春季晴天中午选取外植体。选取的环境最好在室内，春天对植物的污染程度较低，于晴天进行采集，可以明显看出植物自身的细菌要远远小于室外植株[3]。

3.4 外植体清洁和消毒

选取好外植体之后，一定要对其进行清洁和消毒，做到消毒微生物的同时，也要注意降低对外植体造成的伤害。在整个清洁消毒的过程中，一要将外植体表面泥土污垢清洗干净，二要为外植体剪枝，三要将外植体放入烧杯中用洗洁精水泡3min 左右，再用流水对外植体进行全方位的清洗，然后用75%酒精将其浸泡30s 左右。清洁消毒过程中，一定要选择适合的消毒剂，这样能够防止消毒剂对外植体造成的伤害[5]。

3.5 紫外灯照射消毒

紫外灯照射能很好地消毒植物组织培养中出现的污染。首先要清理污染培养基和被污染的区域及器具，同时一定要保持培养室的卫生，培养架也要进行清洁，确保其干净无杂物。接种前，还需用75%酒精喷洒室内进行清洁，这样能使灰尘降落，最后可用紫外灯照射30min 左右，达到最佳清洁消毒的效果。

4 结语

目前社会经济处于快速发展阶段，科学技术也在不断加强，植物组织培养技术也在日趋完善并得到了普遍的应用，但在植物组织培养中还有许多污染方面的问题需要改善。现阶段中，微生物的多样性是研究污染途径的一大难题，其特点是工作人员不能完全辨别污染种类和菌种类别。所以目前对于植物组织培养的工作人员来说，一定要构建出良好的工作环境，严格要求自己，要有防控卫生污染的意识。若想更好地实现植物组织培养技术的价值，不光要正确选用合适的接种材料，消毒工作也要做到全面，更要对植物组织培养中常见的污染开展一系列深层次的探讨和研究，与科学污染防控技术相结合，才能做到有效减少或避免植物组织培养期产生污染的概率。