纳米材料在渔用疫苗中的研究进展

陈信锦，王忠良，黄 瑜，樊博琳，简纪常, ，王 蓓,

（1.广东海洋大学水产学院/广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室/广东省水产经济动物病害控制重点实验室，广东 湛江 524088；2.中国科学院实验海洋生物学重点实验室/中国科学院海洋研究所/海洋生物学与生物技术功能实验室/青岛海洋科学与技术试点国家实验室，山东 青岛 266071）

我国是渔业大国，养殖面积和产量均居世界首位。在我国的水产养殖环境中，传染病已经成为一个不可避免的问题，并造成了严重的经济损失。因此，迫切需要解决水产病害问题，提高水产养殖生产率。虽然鱼病的治疗在过去几年取得了重大进展，已经从大量使用抗生素逐渐转向疫苗开发，这些疫苗包括灭活疫苗、肽亚单位疫苗、重组蛋白疫苗、DNA疫苗和减毒活疫苗，但挑战仍然存在。在水产养殖中通常使用佐剂来提高疫苗效力，虽然佐剂在增强针对病原体的免疫反应方面非常有效，但它们存在不同的副作用。大多数商业渔用疫苗是通过腹腔注射刺激免疫系统对病原体进行防御，而注射疫苗也是目前为止最有效和持久的免疫途径。然而腹腔注射方式有可能会导致不良反应，如肉芽肿［1］、注射部位损伤［2］等。此外，麻醉和搬运也可能会导致鱼类产生应激反应甚至死亡，而且注射鱼类的成本也可能使养殖者望而却步。虽然开发新颖的口服和浸泡接种疫苗方法已取得了不同程度的成功，但其摄取效率难以测量，还需进一步探讨。在这种情况下，研究者将纳米技术引入疫苗开发领域，使用纳米递送系统作为一种替代策略，不仅可以解决上述问题，还可以帮助改善传统疫苗的问题，提高疫苗效力［3］。而且纳米疫苗能够通过增强靶向和触发理想的免疫反应来诱导有效的免疫［4］。目前已经尝试利用多种类型的纳米材料来开发有效的候选疫苗，不同纳米颗粒具有许多不同的理化性质，颗粒的多样性导致了纳米疫苗的不同，每种材料都有自身的优点和缺点，因此每种纳米颗粒开发的疫苗都有待研究探讨。本文总结了作为疫苗递送系统的不同纳米材料，包括聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒、壳聚糖纳米颗粒、脂质体和碳纳米管等，这些递送系统已被描述为鱼疫苗或免疫刺激的递送工具。

1 “聚乳酸-羟基乙酸”递送载体

基于聚合物纳米粒子的药物递送系统是最活跃的研究领域之一，已被广泛研究了60年，目前普遍使用的有聚乳酸-羟基乙酸（polylactic acidglycolic acid，PLGA）、聚乙烯亚胺，这些均已被用于制备纳米疫苗。从商业角度来看，聚合物纳米颗粒成本低，易于合成，使得该类化合物越来越受青睐。更重要的是聚合物纳米粒子可以提供靶向药物递送，使药物在体内缓慢释放而不引起单核吞噬细胞系统的激活，具有非免疫原性、无毒、水溶性以及良好的生物降解性和生物相容性［5］。Xu等［6］证实了装载有卵清蛋白抗原表位的聚酰胺纳米复合物可有效用于疫苗递送，并能够避开内溶酶体系统而诱导强大的抗原特异性细胞免疫。此外，疫苗递送效果受聚合物纳米颗粒大小影响，纳米粒子小于300 nm的免疫效果更好，可使机体产生更高的抗体效价，而且较小颗粒对于抗原的吸附量更高。但想要延迟释放抗原，较大的聚合物纳米颗粒为更优选择［7］。

1.1 PLGA包裹细菌抗原的研究

PLGA是用于药物输送最常用的可生物降解聚合物之一，通常由乳酸和羟基乙酸随机聚合而成［8］。PLGA纳米颗粒疫苗是典型的封装疫苗，是疫苗递送系统的首选，除了其出色的安全性和商业化，更重要的是该疫苗可以减轻针对自身抗原的异常免疫反应，同时保留针对外来抗原和病原体的免疫反应［9］。目前，在鱼类中普遍使用的PLGA纳米颗粒制备方法是复乳化溶剂挥发法，其基础是将适量的PLGA溶解在有机溶剂中，如二氯甲烷、氯仿或乙酸乙酯等，然后经超声、搅拌和挥发处理制成纳米颗粒复合物。在大西洋鲑鱼研究中，PLGA纳米颗粒可诱导轻微的炎症反应，而包裹模型抗原和β-葡聚糖后大大增强了对免疫的促炎反应，具有疫苗佐剂的潜力［10］。在随后的研究中，同一小组评估了聚乳酸-纳米颗粒（PLA-NPs）和聚乳酸-羟基乙酸纳米颗粒（PLGA-NPs）包裹γ-球蛋白和β-葡聚糖在鲑鱼中的免疫效果，证实PLA和PLGA能够诱导更高的特异性抗体应答［11］。Rauta等［12］比较了同样具有良好机械强度的PLA-NPs与PLGANPs对嗜水气单胞菌外膜蛋白抗原的包埋效果，PLGA-NPs的包封率和载药量均比PLA-NPs高，而且体外释放速度也快于PLA-NPs，这可能由于PLGA的亲水性更强。

目前为止，灭活疫苗占水产养殖业总疫苗使用量的很大比例，为了提高疫苗效力，广泛使用了佐剂。用PLGA包裹嗜水气单胞菌福尔马林灭活细胞疫苗（FKC疫苗）接种鲤鱼后，PLGA可以作为一种佐剂诱导细胞介导的免疫，增强IL-1b和TNF-a的mRNA相对表达［13］。而另一项研究中，牙鲆接种PLGA包裹的FKC疫苗后也得到相同结果，并且两次生物测定中牙鲆存活率为100%［14］。此外，将质粒DNA包裹在PLGA-NPs中对大西洋鲑鱼肌肉注射后，发现PLGA-NPs包裹后的DNA疫苗可持续释放，能有效上调抗病毒反应，增强DNA疫苗的免疫原性［15］。

1.2 PLGA作为口服疫苗载体的研究

在渔用疫苗中，口服和浸泡可能是最理想的接种方式，将编码淋巴囊肿病病毒（Lymphocystis disease virus，LCDV）主要衣壳蛋白（Major capsid protein，MCP）的质粒包裹在PLGA-NPs中，并在牙鲆中进行检测，攻毒后PLGA-NPs包裹的DNA疫苗组LCDV感染率为16.7%，裸DNA疫苗组感染率为100%，并在接种后10～90 d，鳃、肠、脾、肾中均检测到MCP基因的表达［16］。间接证实了PLGA纳米颗粒可能有助于抗原穿透微血管和肠道上皮，并有效地被吸收。尽管这项研究证实PLGA纳米颗粒可作为DNA疫苗的有效口服载体，但其包封率和载药量较低的问题仍需要解决［16-19］，而且口服免疫的抗原剂量和持续时间还需要优化［18-19］，以期在接种的鱼类中诱导最高的保护作用。在另一项研究中，PLGA-NPs与壳聚糖（Chit）共同包裹迟缓爱德华氏菌DNA疫苗，与PLGA-NPs和Chit-NPs相比，PLGA-Chit-NPs对DNA疫苗的负载效率更高，而对露斯塔野鲮也有更好的保护，同时增强了IgM、IgD和IgZ的mRNA表达并驱动特异性粘膜免疫，这可能与壳聚糖带正电荷有关［20］。因此，PLGA作为口服疫苗递送系统还需要进一步研究。

2 “壳聚糖”递送载体

壳聚糖是一种天然高分子聚合物，由甲壳素脱除部分乙酰基形成的产物，因其具有良好的生物相容性和生物降解性而具有广泛的生物医学应用前景。此外，壳聚糖还具有良好的生物粘附性和阳离子聚电解质性质，可提供强正电与带负电的细胞膜发生离子相互作用，使其具有更高的被抗原呈递细胞（Antigen-presenting cells,APC）吸收的能力。很多研究已经证明了壳聚糖在鱼类上的有益应用，在这些研究中，壳聚糖纳米颗粒通过饲料口服给药，可以促进生长、提高水产动物的免疫抗病能力和改善血液学指标［21］。在鲢鱼传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗研究中，聚肌胞苷酸、壳聚糖、山莨菪碱和IMS1312佐剂均能显著提高抗病毒功能，但壳聚糖对于鲢鱼具有更好的保护，是优先选择的佐剂［22］。

2.1 壳聚糖作为口服疫苗载体的研究

目前，壳聚糖主要用于口服疫苗研究，在浸泡疫苗中也有少量报道。将诺达病毒的DNA疫苗包裹在壳聚糖中并将其整合到鱼类饲料中，鲈鱼口服后激发特异性抗体的产生，而且该口服疫苗能对欧洲鲈鱼幼鱼提供部分保护作用（45%）［23］。将DNA疫苗（PGPD+IFN）与壳聚糖纳米粒进行纳米偶联，对露斯塔野鲮进行口服、浸泡和注射给药，免疫后7～21 d IgM的产生逐渐增加，而口服组抗体滴度较高，其次是浸泡组，此外，在艾美耳球虫攻击后，口服免疫的露斯塔野鲮相对存活率最高（81.82%），其次是浸泡免疫组（72.73%），结果显示，壳聚糖包裹的口服疫苗效果具有相当大优势［24］。而Ramos等［25］研究表明，壳聚糖可使质粒DNA免受胃酸降解，研究者将一种表达β-半乳糖苷酶的报告基因包裹在壳聚糖中，与饲料一起投喂罗非鱼，免疫后在罗非鱼的胃、脾和鳃中可以检测到β-半乳糖苷酶的表达。这些研究间接验证了壳聚糖是转移质粒DNA的有效口服载体，协助质粒DNA被机体吸收，这种载体的使用可能有助于保护质粒DNA不被食道和胃肠道中的核酸酶和酸降解。

另有研究表明，在pH2.0和pH4.5时，壳聚糖包裹的纳米复合物呈现较完整的球形，并能在此条件下持续2 d释放鳗弧菌胞外产物；而在pH7.4和pH9.0时，复合物逐渐变得疏松，之后裂解沉淀［26］。此外，在对壳聚糖进行化学修饰后，纳米复合物的包封率达到92.38%，接种后血清抗体效价、溶菌酶活性以及免疫相关基因表达显著升高，斑点叉尾鮰生物相对存活率也从30%提高到60%［27］。而用海藻酸钠和PLGA修饰的壳聚糖包裹嗜水气单胞菌外膜蛋白，更是大大提高了复合微球包封率，诱导更强的免疫应答并持续9周［28］。大量研究已经证明了壳聚糖在鱼类上的有益应用，如在鲮鱼、虹鳟鱼、草鱼、罗非鱼、大菱鲆和鲤鱼的饲料中添加壳聚糖［29-30］表明，壳聚糖可以促进生长、提高天然免疫力、疾病和抗应激能力，改善血液学指标，改善水质。因此，壳聚糖可用于向水产养殖中的鱼类输送免疫刺激剂或疫苗。

2.2 壳聚糖作为浸泡疫苗载体的研究

将壳聚糖修饰的柱状病毒仿生纳米疫苗浸泡罗非鱼30 min，在接种后30、60 d，有大于60%的罗非鱼得到保护，与对照组相比成活率显著提高57%［30］。Kole等［31］首次报道将灭活的病毒性出血性败血症病毒（Viral haemorrhagic septicaemia virus，VHSV）全病毒抗原包埋于壳聚糖中，通过浸泡途径和口服途径接种牙鲆，结果牙鲆内血清、皮肤粘液和肠道粘液中的抗VHSV抗体效价均显著提高，而浸泡效果优于口服效果，这与壳聚糖包裹DNA疫苗效果相反，可能是口服免疫无法保护全病毒抗原导致在肠道中酶解。鱼的体表有丰富的粘液，这种粘液含有粘蛋白，具有粘弹性和粘附性以及保护作用，这些粘膜特性可用于药物控制释放和免疫调节。

3 “脂质体”递送载体

脂质体是球形的封闭结构，由磷脂双层组成，能将周围部分溶剂包裹到其内部。脂质体具有高安全性、生物降解性、生物相容性以及可同时装载亲水性和疏水性制剂的能力，在疫苗递送系统中，脂质体是最广泛使用的疫苗递送载体之一［32］，它不仅缓慢释放抗原并保持抗原的完整性，还能增加APC细胞吞噬颗粒的能力，从而促进体液和细胞免疫应答的诱导［33］。此外，作为免疫佐剂，脂质体比市场普通免疫佐剂能够更有效地诱导机体产生体液免疫应答［34］。

3.1 脂质体包裹病毒抗原和细菌抗原的研究

将编码VP2衣壳蛋白的质粒包裹在脂质体中，然后整合到饲料中饲喂大西洋鲑鱼，结果大西洋鲑鱼体内白细胞与单核细胞数量显著增加，而且双剂量免疫组（13%）、单剂量免疫组（16%）死亡率均低于肌肉注射组（20%）和对照组死亡率（38%）［35］。与传统疫苗不同的是，负载免疫刺激剂的纳米脂质体能保护鱼类免受细菌和病毒的感染。例如脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）和聚肌胞苷酸（Poly I:C）等病毒dsRNA的合成类似物，是一种与病毒感染相关的分子模式。同时包裹Poly I:C和LPS的脂质体能引起斑马鱼免疫相关基因显著上调，可为70%～80%的斑马鱼提供有效保护，降低鱼类幼体对疾病的易感性［36］。

在脂质体中，阳离子脂质体与带负电荷的脂质体或中性脂质体相比，阳离子脂质体是更有效的佐剂，与重组质粒结合时能够减少质粒用量、提高免疫应答水平［37］。同时阳离子脂质体被认为是DNA疫苗最有前景的递送载体之一，因为它们可以凝结形成带正电的强脂质体-DNA复合物，从而保护质粒DNA免受核酸酶的消化，并促进细胞膜的穿越和进入细胞质，激活T细胞［38］。将dsRNA-YHV蛋白酶基因（dsYHV）分别包裹在4种阳离子脂质体中，基于胆固醇的阳离子脂质体-dsYHV复合物可使南美白对虾避免黄头病毒（YHV）感染，且降低病毒保护中有效的dsRNA浓度并延长dsRNA活性［39］。

3.2 脂质体包裹其他化合物的研究

肉桂醛是从肉桂中提取的一种天然化合物，被包裹在脂质体中。这些脂质体对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈氏弧菌（Vibrio harveyi）和迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）具有抑菌效果，随着脂质体浓度增加抑菌效果显著上升，与肉桂醛相比，肉桂醛脂质体易溶于水，更适于疫苗递送载体［40］。此外，干扰素α（IFN-α）疫苗包埋于脂质体后注射到草鱼中，在草鱼肝、肾、脾和肠中可检测到IFN-α、干扰素调节因子1（IRF1）、信号转导子和转录激活因子3（STAT3）等免疫相关基因表达，保护草鱼免受草鱼呼肠孤病毒感染［41］。

4 “碳纳米管”递送载体

碳纳米管（Carbon nanotubes,CNT）是合成的具有圆柱形纳米结构的碳同素异形体，由呈六边形排列的碳原子构成数层到数十层的同轴圆管，一般分为单壁碳纳米管（Single-walled carbon nanotubes,SWCNT）和多壁碳纳米管（Multi-walled carbon nanotube,MWCNT）。因碳纳米管具有高比表面积、易功能化、酶底物催化性、良好的生物相容性等优点而广泛应用于药物传递系统［42］。作为一种极具潜力的纳米载体，碳纳米管能将大量抗原/佐剂递送至APC细胞，具有递送靶向性和低毒性，同时具有多种结构形态以及跨细胞脂质双层增强转运［43-45］。在渔用疫苗应用中，碳纳米管作为递送系统的研究最近才开始，研究重点是碳纳米管与蛋白质的功能化以及DNA疫苗封装。

4.1 碳纳米管作为多肽和蛋白质载体的研究

大多数生物大分子，如蛋白质，由于细胞膜的选择渗透性而不能进入细胞，这阻碍了疫苗的应用。而碳纳米管承载的蛋白质可以通过受体介导的内吞作用或被动运输将疫苗装载到细胞内。研究表明，基于SWCNTs的浸泡疫苗可增强免疫相关基因（IgM,TGF-β,IL-1β,IL-8,TNF-α,CD4）的表达，使相对存活率提高了15%～30%［46-49］。与注射疫苗相比，Zhang等［49］针对鲤鱼病毒血症设计了注射和浸泡两种接种方式，而特异性抗体的产生在接种后第4周达到高峰，其他免疫参数如血清溶菌酶活性、补体活性或碱性磷酸酶活性也被激发。重要的是，在抵抗鲤鱼病毒血症中，浸泡免疫和肌肉注射的SWCNTs-pET32a-G组均高于pET32a-G组，但浸泡接种方式的相对存活率为52.6%，较肌肉注射方式（71.1%）低，表明碳纳米管疫苗可能是一种潜在有效的针对鱼类病毒病原体的浸泡疫苗。而在对碳纳米管进行化学修饰后，可显著提高浸泡疫苗的功效，用纯化的草鱼呼肠孤病毒VP7蛋白与甘露糖修饰的碳纳米管结合获得CNTs-M-VP7疫苗，通过浸泡方式接种草鱼，结果显示草鱼的成活率为96%，CNTs-M-VP7可以显著诱导APC细胞的成熟和呈递过程，引发强大的免疫反应［50］。基于目前的研究趋势，碳纳米管在渔用浸泡疫苗的递送系统具有广泛应用前景。

4.2 碳纳米管作为基因载体的研究

通过对碳纳米管表面修饰，核酸可以和碳纳米管结合。研究证明，与普通的裸DNA疫苗相比，这种碳纳米管-核酸复合物可以有效避免DNA在组织中的快速清除和降解，延长DNA疫苗在体内的使用时间，将锦鲤疱疹病毒的DNA疫苗装载到碳纳米管，经肌肉注射后鱼中抗体水平和免疫相关酶活性显著提高，免疫持续时间也有所提高［51］。此外，将编码鲤鱼病毒血症蛋白的DNA包裹在碳纳米管中，经浸泡给药后诱导了显著的抗体免疫反应，并能对鲤鱼提供中等水平的保护（相对存活率46.3%）［52］。另一种传染性脾肾坏死病毒蛋白构建的DNA疫苗被碳纳米管包裹后，通过浸泡接种鳜鱼幼鱼，MCP基因在肌肉、脾脏和肾脏组织中均有表达；在疫苗接种后14 d，82.4%的鳜鱼幼鱼免受传染性脾肾坏死病毒的攻击［53］。Jia等［54］研究表明，碳纳米管是一种通过浸泡给药的优秀DNA递送系统，相较于裸DNA疫苗可提高相对存活率52.6%。可见，碳纳米管是一种很有前景的DNA疫苗载体，有可能通过浸泡给药的方式大规模用于幼鱼的免疫。

5 展望

纳米疫苗免疫递送系统是抗原递送系统研究领域中的热点。纳米材料具有可降解性、靶向性和药物缓释性等良好特性，已被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）认定为可用于人的可降解的高分子材料，因此，纳米递送系统在未来的疫苗市场具有广阔的应用前景。但目前纳米颗粒用于水产养殖的研究仍处于早期阶段，而市场上也没有基于纳米递送系统的疫苗，尽管疫苗递送的纳米技术克服了许多现有障碍，但还存在许多亟待解决的问题，比如纳米材料种类繁多，一种或多种材料使用效果不一，因此不能合成一种单一的尺寸和形状，而是每种疫苗具有不同的最佳大小和其他属性。在水产养殖中，口服和浸泡是最理想的免疫途径，但目前对鱼的免疫系统仍有许多方面未清楚，如口服和浸泡疫苗后涉及哪些细胞类型或粘膜免疫作用。至今，纳米颗粒用于水产疫苗研究最多的是DNA疫苗，但目前只有一种商业DNA疫苗在加拿大获得了许可，尽管如此，它们仍是最有前途的对抗病毒感染的工具，因此，开发新型的包囊系统改善它们的管理和效率非常重要。

聚合物纳米颗粒、壳聚糖纳米颗粒、脂质体纳米颗粒和碳纳米管等用于纳米疫苗递送系统，能实现更好的APC识别和激活，而这种稳定的递送系统确保抗原准确递送至APC诱导机体产生一系列免疫应答，使疫苗在体内缓慢释放而减少重复接种。此外，纳米颗粒的稳定性也使其在体内过度聚积的风险相对较低。免疫反应的类型和质量可以通过改变颗粒的尺寸大小、电荷大小和形状等来改变。目前，PLGA和壳聚糖的研究较多，其性质和用法也较清楚，但其特性会发生变化，因此需要验证抗原的功能结构、稳定性和免疫原性。而碳纳米管或固体脂质纳米粒仍处于早期开发阶段，但已显示出较好的预期效果，特别是碳纳米管，在国内的研究相当多，其对于疫苗的包裹效果非常好。此外，纳米材料用于渔用疫苗递送系统，具有疫苗佐剂效果。尽管纳米粒子具有很好的生物降解性，但在水中可以检测到纳米材料降解产物的毒性，而在体内是否可完全清除尚未清楚，还需要深入研究。总的来说，纳米材料用于疫苗递送系统是一个非常有前景的策略，能促进养殖鱼类有效疫苗的开发，并明显改善渔用疫苗给药途径。