辽宁地区43133例孕妇常见耳聋基因筛查结果分析

张萌 赵艳辉 赵肖月 赵妍 史楠楠 庞泓

辽宁省沈阳市妇婴医院遗传科（沈阳 110000）

耳聋在我国发病率约1‰～3‰[1]，其中90%以上的耳聋患者出生在无耳聋家族史的家庭[2]。耳聋的发生主要与遗传因素和环境因素等有关，其中遗传因素占60%[3]。遗传性耳聋根据患者是否伴有耳外组织器官的发育异常或功能障碍可分为综合征型耳聋和非综合征型耳聋，约70%遗传性耳聋为非综合征型，其主要遗传方式为常染色体隐性遗传[4]。中国人群的聋病分子流行病学调查显示：我国常见的耳聋相关基因包括GJB2、SLC26A4、mt12srRNA及GJB3[5]。本研究采用微阵列基因芯片技术对43133例听力正常孕早期妇女进行中国人常见4个耳聋基因9个突变位点的检测，探讨本地区听力正常孕早期妇女中常见遗传性耳聋基因致病突变携带情况，建立可行的遗传性耳聋防控产前筛查和产前诊断流程。为推广遗传性耳聋防控工作提供科学参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究的研究对象为2014年7月-2020年11月就诊于沈阳市妇婴医院产科门诊的43133例孕早期孕妇。对受检者及其配偶进行基本情况的采集，受检者在充分知情同意的情况下，签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 血液标本采集

按照外周血采集标准操作流程，采集受检者前臂外周血2-3mL到EDTA抗凝管，存放于医用冰箱4℃保存。

1.2.2 DNA提取

DNA提取应用血液基因组非柱式提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司），提取DNA合格浓度在 100-200ng/μL，纯度 OD260/280在 1.7-2.0之间。

1.2.3 聚合酶链反应（PCR）扩增

针对9个突变位点的9组引物分成A和B两个反应体系分别进行多重PCR扩增。将晶芯九项遗传性耳聋基因芯片检测试剂盒（北京博奥生物有限公司）中的PCR扩增引物混合物和试剂混合物分别充分混合（A、B管）后分装，加入3μL的DNA样本。预变性处理：37℃10min，95℃15min，96℃1min；扩增条件：94℃30s、55℃30s、70℃45s共32个循环，60℃10min。

1.2.4 杂交

从同一样本模版的两个不同扩增体系管（A、B）中各取3μL PCR产物加入到杂交缓冲液管中，充分混匀后用移液器将杂交反应混合物经芯片盖玻片上的加样孔垂直加入到芯片上后将密封好的杂交盒立即放入60℃的杂交仪器中60min。

1.2.5 芯片洗涤

取出杂交盒中的芯片放入芯片洗干仪中，程序为：洗涤液 I，42℃2 min，洗涤液 II，42℃1min×2次。1000rpm离心2min甩干。

1.2.6 芯片扫描及结果判读

使用微阵列芯片扫描仪（LuxScan 10K/B）和相应的遗传性耳聋检测芯片判别系统进行信号读取及判断。针对9个突变位点，若在同一位点中只有探针W出现阳性信号，判读为该位点野生型；只有探针M出现阳性信号，判读为该位点纯合突变型；两者均出现阳性信号，判读为该位点杂合突变型。针对mt12SrRNA基因突变位点，只有探针M出现阳性信号判读为均质突变，两者均出现阳性信号判读为异质突变，只有探针W出现阳性信号，判读为该位点野生型。

1.2.7 基因测序

对GJB2和SLC26A4基因突变携带者配偶及产前诊断羊水样本进行基因测序。外周血样本采用EDTA抗凝管采集3-5mL，产前诊断羊水样本采用羊水8-10mL离心后使用磁珠提取纯化试剂盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因组DNA；利用多重PCR技术扩增富集基因组DNA中靶序列并引入样本标签序列；利用多重PCR扩增技术扩增目的片段经纯化后，在DNA聚合酶、连接酶、磷酸酶的作用下完成PCR产物两端特殊接头的连接，经过纯化后完成文库的制备；文库质检后，将多个文库混合为1个上机文库；采用双脱氧链终止法在测序仪（Applied Bio systems 3130，美国）上进行测序，获取序列碱基信息，并将测序结果与标准序列进行对比。

2 结果

2.1 孕早期妇女基因芯片筛查结果

43133 例受检者中，检出2193例耳聋基因致病突变携带者，实际携带者人数为2167例，其中25例孕妇为双杂合突变携带者及1例孕妇为GJB2基因杂合突变携带者同时伴有mt12SrRNA基因异质突变见表1。突变携带率为5.08%（2193/43133），检出GJB2基因1223例（2.84%,1223/43133）、SLC26A4基因 734 例 （1.70%,734/43133）、GJB3基 因 144 例（0.33%,144/43133）、mt12SrRNA基 因 92 例 （0.21%,92/43133），各个基因的具体位点分布情况见表2。随访到的携带者孕妇而配偶相应基因检测未见异常的患者中，暂未发现新生儿有听力异常者。

表1 26例同时携带两个不同耳聋基因变异患者的基因型及表型Table 1 Genotype and phenotype of 26 carriers of double heterozygousvariants of hereditary deafness gene

表2 2193例正常听力孕早期携带者各个基因位点突变种类、例数及占比Table 2 Mutation types,number and proportion of each gene locus in 2193 normal hearing women in early pregnancy

2.2 携带者配偶相应基因测序及结果

1957例GJB2及SLC26A4基因致病变异孕早期妇女中，1479例配偶知情选择性进行了相应基因测序，检测出基因突变携带者为115例见表3。其中，发现夫妇双方为同一基因致病突变携带者43例。另外根据配偶相关基因测序结果，需要孕妇再次采血进行相关基因测序的人数为27例，均未检测到存在配偶突变基因上的位点突变。

表3 115例携带基因突变的孕妇丈夫相关基因测序情况Table 3 Related gene sequencing results of husbands of pregnant women with gene mutation

2.3 基因型冲突夫妇产前诊断结果及妊娠结局

为同一基因致病突变携带者的43例夫妇中，19例行知情选择性产前诊断。其中4例胎儿检测出同一基因复合杂合突变；7例胎儿检测出单一位点突变，后期随访均未发现新生儿存在听力异常；8例胎儿未检出致病变异，后期随访均未发现新生儿存在听力异常见表4。

表4 19例行产前诊断家庭基因型分布情况及产前诊断结果Table 4 Genotype distribution and prenatal diagnosis results of 19 routine prenatal diagnosis families

24例孕妇与配偶基因型冲突但未进行产前诊断的家庭中，1例发生自然流产；2例胎儿出生后诊断为大前庭导水管综合征并已经进行了人工耳蜗植入；1例胎儿出生后听力筛查未过，在进一步的诊断和治疗中；其余20例新生儿听力暂未见异常。

2.4 携带mt12SrRNA基因突变病例的家系分析及用药指导

共检测出mt12SrRNA基因致病变异92例，其中m.1555A＞G均质/异质突变83例，m.1494C＞T均质/异质突变9例。对上述所有受检者进行了详细的家系分析及遗传咨询。

3 讨论

2013年世界卫生组织（WHO）发布的最新评估数据显示,全球目前共有3.6亿人存在不同程度的听力障碍,占全球总人口的5%。研究显示，目前已经明确的耳聋相关基因已有200多个[6]。在我国，由常见的耳聋相关基因GJB2、SLC26A4和mt12SrRNA突变所导致的耳聋占遗传性耳聋的30%～40%，其中约21%的遗传性耳聋与GJB2基因相关，约15%与SLC26A4基因相关，约4%与mt12SrRNA基因突变相关[7]。

GJB2基因突变是遗传性耳聋最常见的致病原因，临床表型具有明显的多态性。GJB2基因编码缝隙连接蛋白26（Cx26），在声音传导过程中，Cx26蛋白对钾离子经内耳毛细胞循环回流进入耳蜗内淋巴液起调节作用，发生突变后Cx26蛋白的生物活性丧失，钾离子进入内淋巴循环受影响，导致感音神经性聋[8]。本地区育龄期妇女GJB2基因突变检出率为2.84%（1223/43133），与文献报道相似[9,10]。其中c.235delC位点检出率居首位为2.02%（873/43133），其次为c.299-300delAT位点检出率为0.56%（241/43133）。根据对携带GJB2基因突变孕妇配偶的基因检测结果，c.109G＞A位点检出率最高为32.1%（37/115），该位点突变的致病性既往存在争议，但目前多数专家认为此突变仍为致病性突变，但其引起的听力表型差异较大[11]，因此在本地区若GJB2基因（例如c.235delC）突变携带者配偶检出c.109G＞A位点杂合突变，建议行听力检查监测评估听力水平，并定期进行听力监测。

SLC26A4基因编码氯-碘离子转运蛋白Pen‐drin,作为氯离子转运体，调节内淋巴液的离子平衡。在内耳，氯离子转运障碍可导致内淋巴液成分的改变、内淋巴囊液体潴留及内淋巴管扩张。且由于渗透压改变和成分改变的毒性机制导致膜迷路感觉上皮细胞的损伤，进而导致后天中度以上感音神经性耳聋[12,13]。本地区育龄期妇女SLC26A4基因的检出率为1.7%（734/43133），仅次于GJB2基因，其中c.919-2A＞G位点突变检出率最高为1.38%（597/43133），与文献报道相似[14-16]。在针对SLC26A4基因突变携带者配偶的检测中我们发现，除了c.919-2 A＞G、c.2168A＞G最常见的致病变异以外，还检出了携带c.1975G＞C杂合突变3例、ivs15+5G＞A杂合突变1例、c.1286C＞A杂合突变1例、c.2027T＞A杂合突变1例、ivs19+2T＞A杂合突变1例、c.2029C＞T杂合突变1例、c.1197delT杂合突变1例、c.757A＞G杂合突变1例、c.697G＞C杂合突变1例、c.1522A＞G杂合突变1例，以上突变位点均为致病性突变并且目前尚未纳入本地区常规遗传性耳聋基因筛查范围，这意味着有一部分相关基因的携带者存在漏筛风险并且提示我们扩大耳聋基因筛查位点的范围，提高耳聋相关基因检出率。

mt12SrRNA基因突变是药物性耳聋发生的遗传基础，该基因发生突变后，使其编码区域的结构发生了改变，改变后的结构与细菌核糖体基因结构非常相似，当接触氨基糖甙类抗生素时，它与氨基糖甙类抗生素结合能力增加，阻碍了线粒体核糖体蛋白的合成，进而导致耳蜗的外毛细胞逐渐死亡导致永久性耳聋[17]。本地区育龄期妇女mt12SrRNA基因突变的检出率为0.21%（92/43133），以m.1555A＞G最为常见。由于mt12SrRNA基因的遗传方式以母系遗传为主，我们对所有筛查出该基因的携带者均告知被检者及其母系成员终身禁止使用氨基糖苷类药物，并且为携带者发放用药指导卡片，避免药物聋的发生。GJB3基因是我国克隆的第一个基因，本地区GJB3基因携带率为0.33%（144/43133），该基因538C＞T位点突变被认为与高频听力下降有关[18]。

大部分以耳聋为唯一症状的非综合征型耳聋主要的遗传方式为常染色体隐性遗传，有大量人群为听力正常的隐形耳聋基因携带者，因此为生育年龄听力正常人群进行常见耳聋基因检测是十分必要的。本地区采用的筛查流程为首先为育龄期妇女进行常见耳聋基因筛查，对携带者配偶进行相关基因检测，当夫妇双方为同一基因致病突变携带者时，建议在孕妇孕周为16周-22周+6区间通过羊水穿刺的方式进行产前诊断，对采集到的羊水细胞进行相关基因高通量测序进而明确胎儿基因型，进一步实现降低遗传性耳聋出生缺陷的目的。本地区筛查高风险家庭的产前诊断率为44.19%（19/43），在选择进行产前诊断的家庭中，发现胎儿耳聋风险为100%的家庭占比21.05%（4/19）。根据随访结果，在24个放弃产前诊断的高风险家庭中，有3个家庭胎儿出生后发现存在听力异常。因此，加强对耳聋基因的宣传、加大遗传咨询的力度，进一步增强大众对遗传性耳聋的认知是十分必要的。

耳聋给家庭和社会都带来极大的负担，并且目前没有耳聋的有效药物治疗方案，大多数耳聋患者只能依靠佩戴助听器或植入人工耳蜗等辅助手段进行治疗，因此做好耳聋的三级防控工作至关重要。随着越来越多的遗传性耳聋基因被克隆和鉴定，让我们可以从分子的水平上全面的认识耳聋发生发展的过程并为临床上开展耳聋基因检测与诊断打下了坚实的基础。因此，依靠先进的分子检测技术在本地区建立适宜的遗传性耳聋基因筛查流程，在原有的基础上扩大致病位点的筛查范围，并且通过多方面渠道加强对遗传性耳聋的宣传，进一步实现降低耳聋出生缺陷的防控目标。