天津地区部分种公猪精液携带细菌性病原的检测与分析

付永利 唐佩娟 崔捷 李文忠 杨婧 孙英峰

摘    要：为了解天津地区种公猪精液中细菌的污染情况及耐药特征，具有针对性地添加抗菌药物，提高常温保存猪精液品质。本研究对2021年天津地区部分种猪场送检的494份精液样品进行了细菌分离，16S rDNA鉴定及耐药性分析研究。结果表明：天津地区公猪精液细菌携带比例高达38.87%（192/494），其中变形杆菌属（Proteus）占26.53%（52/192），葡萄球菌属（Staphylococcus）占23.96%（46/192），棒状杆菌属（Corynebacterium）占22.92%（44/192），肠球菌属（Enterococcus）占11.46%（22/192），大肠埃希氏菌属（Escherichia）占11.46%（22/192），未鉴定3.13%（6/192）;耐药性分析显示5种细菌对四环素、林可霉素等已产生高度耐药，仅对喹诺酮类抗生素敏感，这为猪精液抗生素的使用提供参考。

关键词：公猪精液;细菌鉴定;耐药分析

中图分类号：S859.84         文献标识码：A          DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.11.009

Detection and Analysis of Bacterial Pathogens in Boars Semen in Tianjin Area

FU Yongli1， TANG Peijuan1， CUI Jie1， LI Wenzhong2， YANG Jing2， SUN Yingfeng2

（1. Department of Animal Husbandry and Dairy Technology Promotion Service， Tianjin Agricultural Development Service Center， Tianjin 300061， China; 2. College of Animal Science and Animal Medicine， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300392， China）

Abstract： In order to understand the contamination and drug resistance of bacteria in boar semen in Tianjin area， the experiment collected 494 semen samples from breeding pig farms in Tianjin area in 2021 for bacterial isolation， identified the isolated bacteria by 16S rDNA， and then analyzed the drug resistance of the identified bacteria. The results showed that the rate of bacterial contamination was as high as 38.87% （192/494）， of which Proteus was 26.53% （52/192）， Staphylococcus was 23.96% （46/192）， Corynebacterium was 22.92% （44/192）， Enterococcus was 11.46% （22/192）， Escherichia was 11.46% （22/192）， and unidentified was 3.13% （6/192）. Drug resistance analysis showed that these five bacteria species had high resistance to tetracycline and lincomycin， and were only sensitive to quinolones， which could use for semen preservation.

Key words： boar semen; bacterial identification; drug resistance analysis

近年來，猪人工授精技术在我国生猪生产中已得到越来越广泛应用。通过人工授精技术，可以最大程度提高优良公猪的利用率，改善我国猪群的生产性能，提高我国猪群的品质，也减少了疾病传播及克服地域限制，发挥优良基因的最大经济性能，同时国家相关部门出台扶持政策，更加促进此项技术普及推广，相关专业知识深得人心，这为促使我国养猪业走向集约化、规模化迅速发展提供了技术支撑。

目前，尽管猪场人员在收集和处理精液过程中采取了严格的卫生措施，但在收集和处理精液过程中常发现大量的细菌，造成精液污染，从而直接影响到母猪的受胎率，导致猪场发生流产或死胎等临床疾病[1]。来自不同地区或不同规模猪场的公猪精液中仍存在细菌污染[2]，通常可见革兰氏阴性菌，主要来自粪便、包皮、皮肤和毛发中的微生物，这些细菌可以导致精子活力受损、顶体破坏或膜活力丧失，对精子的质量和寿命产生负面影响[3-4]。为最大限度地减少细菌污染常规保存精液的风险，本研究对不同天津地区部分猪场的公猪精液进行了细菌性病原检测及耐药性分析，确定公猪精液中主要细菌性病原微生物及筛选出抑菌效果较好抗生素，为实施有效的细菌控制策略提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 试验时间与地点

试验于2021年4月到10月在天津农学院动物科学与动物医学学院预防兽医学实验室进行。

1.2 试验材料

1.2.1 精液 2021年4—9月天津市部分地区（蓟州、宝坻、武清、宁河、静海、滨海新区）规模化生猪养殖场的公猪精液。

1.2.2 试剂 分子生物学相关试剂（Buffer、dNTPs、Mgcl2、Taq酶）购置于大连宝生物试剂有限公司;细菌鉴定用引物由上海生物工程有限公司合成;常规药敏片购置于杭州微生物试剂有限公司;血琼脂培养基及巧克力培养基为本实验室配制。

1.3 试验方法

1.3.1 精液细菌分离与生化鉴定 将精液样品接种于鲜血或巧克力琼脂培养基，置于37 ℃培养箱中培养24～48 h后，观察有无细菌生长;如有细菌生长，则观察细菌生长的状况和菌落形态，挑取单个菌落，然后再次接种鲜血或巧克力平板进行细菌纯培养，待纯培养后革兰氏染色，同时记录精液细菌分离培养结果。

1.3.2 精液菌群分子鉴定 采用煮沸法裂解细菌制备DNA，具体步骤：将试验中分离获得细菌接种平板培养基，37 ℃培养18～24 h，然后刮取1～2菌落加入150 μL三蒸水中，混匀，100 ℃煮沸10 min;然后-20 ℃冻30 min， 5 000 r·min-1 离心10 min，取上清液作为模板。16S rDNA细菌鉴定通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），预期片段大小为1 500 bp。PCR反应体系：10×Buffer 2.5 μL、dNTPs2 μL、Taq酶0.5 μL、DNA模板5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、补双蒸水至25 μL。PCR反应程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃延伸10 min，16 ℃ 1 min。按照琼脂糖凝胶电泳标准操作流程对结果進行判定，然后送上海生物工程有限公司进行基因测序，将测序结果在Genebank数据库BLAST对比分析。

1.3.3 精液菌群药敏试验 将本试验分离获得的纯培养的细菌，按照不同分类分别将菌落调至标准比浊度，然后取少量菌液均匀涂布于整个鲜血或巧克力琼脂平板表面，依次贴上不同种类的药敏纸片，然后置于37 ℃恒温箱中培养24 h，用卡尺测量每个药敏纸片的抑菌圈直径，然后根据每种药敏纸片的药物敏感试验判定标准判定细菌对药物的敏感性。本次试验选用β-内酰胺类抗生素（氨苄西林、阿莫西林、头孢曲松钠、头孢噻肟），氨基糖苷类抗生素（庆大霉素、丁胺卡那），喹诺酮类药物（恩诺沙星、左氧沙星、诺氟沙星），四环素类（四环素、多西环素），氯霉素类（氟苯尼考）和林可霉素类（林可霉素）13种药物依次对分离鉴定的不同种属细菌进行药敏试验。

2 结果与分析

2.1 细菌分离培养与分子鉴定

对2021年天津地区部分种猪场送检的494份精液样品进行了细菌分离，结果显示38.87% （192/494）样品分离获得细菌，其中29.17%（56/192）阳性样品存在2种及以上均属多类型细菌感染。结合染色镜检（图1）及16S rDNA测序鉴定（图2），确定变形杆菌属（Proteus）占26.53%（52/192），葡萄球菌属（Staphylococcus）占23.96%（46/192），棒状杆菌属（Corynebacterium）占22.92%（44/192），肠球菌属（Enterococcus）占11.46%（22/192），大肠埃希氏菌属（Escherichia）占11.46%（22/192），未鉴定占3.13%（6/192）。

2.2 药敏试验结果

药敏试验结果（表1）表明，不同种类细菌对药物敏感性差异较大，总体上喹诺酮类药物抑菌效果优于其他抗生素，其详细的抑菌圈直径结果分析如下。

变形杆菌：对喹诺酮类药物（恩诺沙星、左氧沙星、诺氟沙星）及氨基糖苷类抗生素（庆大霉素、丁胺卡那）极度敏感，而对四环素类（四环素、多西环素）、β-内酰胺类抗生素（氨苄西林、阿莫西林、头孢曲松钠、头孢噻肟）和林可霉素类（林可霉素）抗生素具有完全耐受性。

葡萄球菌：对部分β-内酰胺类抗生素（头孢曲松钠、头孢噻肟）和喹诺酮类药物（恩诺沙星、左氧沙星、诺氟沙星）极度敏感，而对四环素类（四环素、多西环素）及林可霉素类（林可霉素）抗生素具有一定耐受性。

棒状杆菌：对β-内酰胺类（氨苄西林、阿莫西林、头孢曲松钠、头孢噻肟）、氨基糖苷类（庆大霉素、丁胺卡那）、喹诺酮类（恩诺沙星、左氧沙星）和氯霉素类（氟苯尼考）等多数抗生素较为敏感，而对四环素类抗生素（四环素、多西环素）和林可霉素类（林可霉素）具有耐药性。

粪肠球菌：对β-内酰胺类抗生素（氨苄西林、阿莫西林、头孢曲松钠、头孢噻肟）及部分喹诺酮类抗生素（恩诺沙星、左氧沙星）具有敏感性，而对四环素类（四环素、多西环素）、氨基糖苷类抗生素（庆大霉素、丁胺卡那）、氯霉素类（氟苯尼考）及林可霉素类（林可霉素）抗生素具有较强的耐受性。

大肠杆菌：对四环素类（四环素、多西环素）、林克霉素类（林可霉素）、β-内酰胺类（氨苄西林、阿莫西林、头孢曲松钠、头孢噻肟）及氨基糖苷类（庆大霉素、丁胺卡那）抗生素具有较强的耐受性，而仅对喹诺酮类抗生素（恩诺沙星、左氧沙星、诺氟沙星）极度敏感。

3 结论与讨论

目前，精液常温保存技术在国内外规模化猪场中已广泛应用，但是在人工操作工程中出现的精液污染问题也越来越多，病原微生物在精液中大量繁殖，影响精子寿命及受孕能力，造成母猪繁殖性能低下[5-7]。张家庆等[8]研究发现，公猪精液中病原菌主要为变形杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、棒状杆菌以及克雷伯菌。王永等[9]从猪精液中分离出细菌主要包括：葡萄球菌、链球菌、铜绿假单胞菌、克雷伯氏菌等。本试验中，天津部分猪场公猪精液细菌携带比例高达38.87%（192/494），其中29.17%（56/192）阳性样品存在2种及以上均属多类型细菌感染，主要为变形杆菌属（Proteus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、粪肠球菌属（Enterococcus）及大肠埃希氏菌属（Escherichia）。这些类型细菌均为条件性致病菌，且广泛存在于生猪生殖道、土壤等环境中，操作不规范极易造成精液污染。由此判断，在很大程度上，精液的污染与人为操作过程有关。

在生猪疾病防控过程中，可选用药敏试验进行药物敏感度的测定，以便准确有效的利用药物进行治疗[10-11]。本试验结果显示，不同种属细菌体外药敏试验结果差异较大，如猪场公猪精液分离的大肠杆菌对大环内酯类抗生素、洁霉素类以及氟苯尼考有较强的耐受性，而对其他抗生素敏感，特别是对喹诺酮类极度敏感;克雷伯菌除对克林霉素具有耐药性外，对其他抗生素都具有敏感性;变形杆菌对喹诺酮类极度敏感;棒状杆菌对大环内酯类与喹诺酮类抗生素敏感[5];根据本试验结果与数据分析，可以得出天津地区公猪精液常见5个菌属，即变形杆菌属、葡萄球菌属、棒状杆菌属、粪肠球菌属及大肠埃希氏菌属，喹诺酮类药物总体抑菌效果优于其他抗生素。

研究证实，生猪精液污染病原微生物病毒性微生物，细菌污染是临床较常见微生物，同时可能出现污染环节也较多[12]。因此，为降低公猪精液污染情况，笔者建议对公猪定期保健，提高种猪体质;严格执行采精标准操作程序，尽量减少精液过程污染;选用较好的稀释液，提升精液在常温保存效果;在条件允许情况下，可根据药敏试验结果选用高敏感性抗生素，提高抑菌效果与储存时间，以此提高优秀种公猪的利用率。

天津部分地区公猪精液细菌污染严重，主要包括变形杆菌属、葡萄球菌属、棒状杆菌属、粪肠球菌属及大肠埃希氏菌属;耐药性分析显示已对四环素、林可霉素等已产生高度耐药，仅对喹诺酮类抗生素敏感，这为猪精液抗生素的使用提供参考。

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收稿日期：2021-09-24

基金项目：天津市生猪产业技术体系创新团队项目——精细化养殖岗位（ITTPRS2021008）

作者简介：付永利（1964—），男，天津人，高级畜牧师，主要从事生猪高效生产技术方面研究。

通讯作者简介：孙英峰（1979—），男，山东人，教授，博士，主要从事生猪疫病诊断与防控方面研究。