不同生长时期的紫花苜蓿对低温的响应及其抗寒性研究

李佳奇， 刘晓静， 运向凯， 韩颜隆

(甘肃农业大学草业学院,草业生态系统教育部重点实验室,甘肃省草业工程实验室, 中-美草地畜牧业可持续发展研究中心， 甘肃 兰州 730070)

低温是限制牧草生长发育、地理分布和生产力的主要非生物胁迫因子[1-3]。在对青藏高原3个披碱草(Elymusdahuricus)属牧草的苗期抗寒性研究中发现，低温会引起植物细胞膜透性增大，电解质渗透率升高，而植物质膜透性越强，其细胞与组织就越容易受到损害，从而影响其产量和品质[4]；在对鹅观草(RoegneriakamojiOhwi )与早熟禾(PoaannuaL.)的研究中发现，在低温胁迫条件下，牧草细胞内产生主要为可溶性糖和游离脯氨的渗透调节物质，缓解在低温胁迫下对植物伤害的发生[5-6]。关于牧草的抗寒研究还集中在品种之间的差异，如贾祥等研究4种禾本科牧草的抗寒性后发现，低温环境下垂穗披碱草(ElymusnutansG.)、紫花针茅(StipapurpureaG.)的抗寒性最为优良[7]；梁国玲等对4种羊茅属牧草的幼苗抗寒性进行了研究，其中中华羊茅(FestucasinensisKeng)的抗寒性最为优良[8]；赵桂琴等对4℃下不同品种红三叶(TrifoliumpratenseL.)苗期的生理响应进行研究，发现R-1品种抗寒性最好[9]。紫花苜蓿作为优质的多年生豆科牧草，在畜牧业生产上发挥着重要的作用，由于紫花苜蓿具有高产、优质、保持水土、改良土壤、抗旱性较强等优点，是目前我国广泛种植的优质牧草[10]。随着研究的深入，国内外学者对苜蓿抗寒性的研究较多，如郝培彤等[11]研究科尔沁地区不同品种苜蓿根颈耐寒机理；赵一航等[12]对4个紫花苜蓿品种对低温胁迫的响应进行了研究，表明“肇东”与“龙牧801”抗寒性较好；陈卫东等[13]研究表明黄花苜蓿抗寒性优于紫花苜蓿，而关于紫花苜蓿在不同生长时间对低温的响应及耐受性的研究较少。近年来，由于我国种植业结构的调整，我国北方紫花苜蓿种植面积不断扩大[14]，但由于紫花苜蓿在寒冷地区生长受限，其品质下降明显，优良紫花苜蓿品种的缺乏已成为限制北方寒冷地区发展的主要问题之一，筛选出适宜高纬度、高海拔播种的紫花苜蓿品种是提高作物产量的前提，结合北方寒冷地区的气候因素及播种方式可知紫花苜蓿的播种时间一般为秋播，而选择精确的秋播时间是紫花苜蓿能安全越冬的关键因子[15]。因此，本研究拟选取4个在北方广泛种植的紫花苜蓿品种“龙牧801”,“甘农3号”,“WL298”,“WL343”，通过模拟试验对2个紫花苜蓿秋播时期温度及不同播种时间下形态特征及抗逆生理特性的研究，探究紫花苜蓿在不同生长时期对低温的响应及耐受性，确定出紫花苜蓿安全越冬的秋播时期；同时，根据其在低温条件下的成活率筛选出最为适宜的优良品种，以期为北方寒冷地区紫花苜蓿高效栽培提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

紫花苜蓿品种为“龙牧801”,“甘农3号”,“WL298”,“WL343”,“甘农3号”。紫花苜蓿种子来源为甘肃农业大学草业学院，“龙牧801”紫花苜蓿种子来源为黑龙江畜牧研究所，“WL298”与“WL343”紫花苜蓿种子来源为北京正道生态科技有限公司。

1.2 试验设计

试验于2020年8月10日在甘肃农业大学草业学院牧草试验基地室外自然气候条件下进行，采用盆栽土培法，日常管理同田间试验。该试验采用的花盆直径为20 cm，高为12 cm，试验土来自甘肃农业大学牧草试验基地，肥力中等的种植土。试验采用4个紫花苜蓿品种，设置3个不同生长时期(45 d，60 d，75 d)，西北寒冷地区气温最低能够达到-20℃左右，而因土壤热传导率的不同土壤浅层温度最低在-10℃左右。因此，本试验选择-5℃，-10℃进行模拟越冬处理，每个处理重复5次，共120盆。种植前选取颗粒饱满、大小均等的种子，通过预处理后进行播种，每个花盆装入2 kg土壤，穴播，每盆5穴，每穴5～6粒种子，每周浇一次水，使土壤湿润且不溢出，后期间苗每盆留20株。试验中的4个品种紫花苜蓿分别在播种后生长45 d，60 d，75 d时进行模拟越冬的低温胁迫，即将整盆紫花苜蓿放置于温度为-5℃和-10℃，湿度为60%，光照强度为230～300 μE·m-2·s-1，光周期为16 h光照/8 h黑暗的人工气候室(温度误差±1℃)进行逐级降温(降温速率不超过2.5 ℃·h-1)，待温度降到目标温度(-5℃，-10℃)时停止，然后将全部植株移至常温下缓苗24 h，待缓苗结束后进行相关指标的测定。

1.3 测定指标及方法

株高：各处理随机选取10株，用直尺测量植株绝对高度，每个处理重复3次，计算出平均值。

鲜重(地上)：将植株冲洗干净后，用滤纸吸去多余水分，将地上部分称重，每个处理重复15次，计算出平均值。

根重：对单株鲜样的地下部分进行称重，每个处理重复15次，计算出平均值。

根体积：利用Epson根系扫描仪对活根进行扫描，再用WinRHIZO根系分析系统软件获得根体积数据，每处理重复3次，计算出平均值。

主根直径：根颈与主根相连的膨大部位的直径，计算出平均值。

相对电导率：采用电导率仪(DDS-307A)测定。

可溶性糖含量(Soluble sugar，SS)：参照邹琦[16]方法，采用蒽酮法测定含量。单位：μmol·g-1。

可溶性蛋白含量(Soluble protein，SP)：采用考马斯亮蓝G-250染色法测定含量。单位：μmol·g-1。

游离脯氨酸含量(Free proline，Pro)：采用酸性茚三酮法测定含量。单位：mg·g-1。

丙二醛含量(Malonaldehyde，MDA)：采用硫代巴比妥酸法测定含量。单位：μmol·g-1。

成活率(%)=(低温处理后成活植株数/低温处理前植株数)×100%。

1.4 数据分析

采用SPSS 25.0 软件进行计统计分析，差异显著性采用Duncan法进行多重比较。

隶属函数采用韩瑞宏等[17]的计算公式：

隶属函数值计算公式:

R(Xij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

(1)

反隶属函数值计算公式:

R(Xij)=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xmin)

(2)

上式中，Xij为i品种的j性状的隶属函数值，Xij为i品种的j性状值，Xjmin为各品种j性状的最小值，Xjmax为各品种j性状的最大值。当j性状与植物的抗寒性成正相关时，用(1)式；当j性状与植物抗寒性成负相关时用(2)式。数据利用Microsoft Excel 2016处理数据及制图。

2 结果与分析

2.1 不同生长时期紫花苜蓿生长特性

由表1可知，紫花苜蓿的播种时期不同，其株高和地上生物量不同，在75 d达到最大值且显著高于45 d(P<0.05)。其中，在播种45 d和60 d后“WL298”的株高均显著高于其它品种；播种75 d后，“WL343”和“WL298”的株高均显著大于“龙牧801”(P<0.05)。播种45 d后，“WL343”与“甘农3号”的地上鲜重均显著高于“WL298”与“龙牧801”；播种60 d后，“龙牧801”的生物量显著高与其它紫花苜蓿品种；播种75 d后，“WL343”的生物量达到了12.64 g高于其它品种(P<0.05)。

表1 不同时期紫花苜蓿品种的生长特性Table1 Growth characteristics of alfalfa varieties in different periods

2.2 不同生长时期紫花苜蓿根系特性

由表2可知，紫花苜蓿的播种时期不同，其根重、根体积和主根直径不同，总体上在75 d达到最大值且显著高于45 d(P<0.05)。播种45 d后，“龙牧801”的根重显著高于其它苜蓿品种，播种60 d，75 d后，4个紫花苜蓿品种之间根重差异显著，其中，“龙牧801”显著高于其它紫花苜蓿品种(P<0.05)。在3个播种时间下，“龙牧801”根体积显著高于其它紫花苜蓿品种(P<0.05)。在主根直径方面，播种后45 d和60 d，4个紫花苜蓿品种之间主根直径差异不显著；在播种后75 d，“龙牧801”的主根直径显著高于其它苜蓿品种(P<0.05)。

表2 不同时期紫花苜蓿品种的根系特性Table 2 Root characteristics of alfalfa varieties in different periods

2.3 模拟越冬对不同生长时期紫花苜蓿生理特性的影响

2.3.1丙二醛(MDA) 由表3可知，在-5℃与-10℃条件下，4个紫花苜蓿品种在45 d的丙二醛含量均显著高于75 d的丙二醛含量(P<0.05)。在-5℃条件下，播种 45 d和60 d后，“甘农3号”的丙二醛含量显著高于“WL343”与“龙牧801”；在播种75 d后，“甘农3号”的丙二醛的含量显著高于其它紫花苜蓿品种(P<0.05)。在-10℃条件下，播种45 d后，“甘农3号”丙二醛的含量显著高于“龙牧801”；播种60 d后，“甘农3号”的丙二醛含量显著高于“WL298”和“龙牧801”；在播种75 d后，“甘农3号”与“WL298”丙二醛含量显著高于“WL343”与“龙牧801”(P<0.05)。

表3 不同播种时间及不同温度下紫花苜蓿的丙二醛含量Table 3 Malondialdehyde content of alfalfa at different sowing time and temperature 单位：μmol·g-1

2.3.2游离脯氨酸(Pro) 由图1可知，在-5℃与-10℃条件下，4个紫花苜蓿的游离脯氨酸含量均呈上升趋势，并在75 d达到峰值且显著高于45 d与60 d(P<0.05)。在-5℃条件下，播种45，60和75 d后，“龙牧801”的游离脯氨酸含量显著高于其它苜蓿品种(P<0.05)。在-10℃条件下，播种45 d后，“龙牧801”的游离脯氨酸含量显著高于其它苜蓿品种；播种60 d和75 d后，“WL343”的游离脯氨酸含量均显著小于其它苜蓿品种(P<0.05)。

图1 不同播种时间及不同温度下紫花苜蓿的游离脯氨酸含量Fig.1 Free proline content of alfalfa under different sowing time and temperature注：每列中不同字母表示差异达5%水平，小写字母表示不同品种间差异，大写字母表示播种时期间差异，下同Note：Different letters mean significant at 5% level in theTable,lowercase letters indicate the difference between different varieties,and uppercase letters indicate the difference between sowing periods, the same as below

2.3.3相对电导率 由表4可知，在-5℃与-10℃条件下，4个紫花苜蓿品种的电导率均呈下降趋势，表明随着播种时间的增大紫花苜蓿的抗逆性能逐渐增加。在-5℃条件下，播种45 d后，4个紫花苜蓿品种的相对电导率差异不显著；播种60 d后，“甘农3号”电导率显著高于其它紫花苜蓿品种；播种75 d后，“WL298”和“甘农3号”的相对电导率显著高于“WL343”与“龙牧801”(P<0.05)。在-10℃条件下，播种45 d后，“龙牧801”电导率显著低于其它紫花苜蓿品种；播种60 d和75 d后，“甘农3号”与“WL298”电导率显著高于其它苜蓿品种(P<0.05)。

表4 不同播种时间及不同温度下紫花苜蓿的电导率Table 4 Electrical conductivity of alfalfa at different sowing time and temperature

2.3.4可溶性蛋白含量(SP) 由图2可知，在-5℃与-10℃条件下，4个紫花苜蓿品种的可溶性蛋白含量逐渐增加，且在75 d的积累量显著高于45 d与60 d(P<0.05)。在-5℃条件下，播种45 d后，其中“龙牧801”的可溶性蛋白含量显著高于“甘农3号”的可溶性蛋白含量；在播种60 d后“龙牧801”与“WL343”的可溶性蛋白含量显著高于其它紫花苜蓿品种；在播种后75 d，“甘农3号”的可溶性蛋白均显著低于其它紫花苜蓿品种(P<0.05)。在-10℃的条件下，在播种45 d和60 d后，“龙牧801”的可溶性蛋白含量显著高于其它苜蓿品种(P<0.05)。

图2 不同播种时间及不同温度下紫花苜蓿的可溶性蛋白含量Fig.2 Soluble protein content of alfalfa at different sowing time and different temperature

2.3.5可溶性糖含量(SS) 由表5可知，在-5℃与-10℃条件下，4个紫花苜蓿品种的可溶性糖含量呈上升趋势，并在75 d达到峰值，且显著高于45 d与60 d(P<0.05)。在-5℃条件下，播种45，60及75 d后，4个紫花苜蓿品种的可溶性糖含量无明显差异(表5)。在-10℃的条件下，在播种45 d后，“龙牧801”的可溶性糖含量显著低于其它紫花苜蓿品种；播种60 d和75 d后，“龙牧801”可溶性糖含量显著高于其它苜蓿品种(P<0.05)。

表5 不同播种时间及不同温度下紫花苜蓿的可溶性糖含量Table 5 Soluble sugar content of alfalfa at different sowing time and temperature 单位：μmol·g-1

2.4 模拟越冬下不同生长时期紫花苜蓿的成活率

由图3可知，在-5℃与-10℃条件下，4个紫花苜蓿品种的成活率逐渐增大，75 d的成活率显著高于45 d与60 d的成活率(P<0.05)。-5℃与-10℃条件下，不同品种紫花苜蓿低温胁迫后的成活率总体上规律一致，其中在播种后45 d，4个紫花苜蓿品种成活率差异不显著；在播种后60 d，“龙牧801”紫花苜蓿品种成活率显著高于“甘农3号”与“WL298”紫花苜蓿品种；在播种后75 d，-5℃条件下，“龙牧801”的成活率显著高于其它品种而在-10℃条件下，“龙牧801”与“WL343”显著高于“甘农3号”与“WL298”(P<0.05)。

图3 不同苜蓿品种低温胁迫后成活率差异Fig.3 Difference of survival rate of different alfalfa varieties under low temperature stress

2.5 紫花苜蓿模拟越冬下的成活率与其生长特性的相关性

本试验在变量均为正态分布的情况下，利用Pearson相关系数法对4个品种紫花苜蓿的成活率与株高、鲜重(地上)、根重、根体积进行相关性分析(表6)，根据显著性判断，株高、鲜重(地上)、根重、根体积与成活率呈显著相关，根据相关系数可知，株高与成活率显著相关，成活率与地上鲜重、根重、根体积和根直径极显著相关。

表6 成活率与生长特性相关性Table 6 Correlation between survival rate and growth characteristics

2.6 不同生长时期紫花苜蓿抗寒性综合评价

本试验应用隶属函数对4个紫花苜蓿品种的形态指标和生理指标共12项指标进行综合分析(表7)。结果显示：“龙牧801”的抗寒性最强，隶属函数均值达到了0.556，其次是“WL343”与“WL298”“甘农3号”的抗寒性最差，隶属函数均值仅有0.313。

表7 不同生长时期紫花苜蓿抗寒性综合评价Table 7 Comprehensive evaluation of cold resistance of alfalfa in different growth stages

3 讨论

紫花苜蓿选择适宜播种时期是其栽培过程中的重要技术环节，也是影响紫花苜蓿生长发育、产量及越冬的重要因素[18]。本研究中，通过比较4个紫花苜蓿品种3个不同生长时间的生理指标得出，在播种75 d后的可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸及成活率均优于45 d和60 d。研究还发现，通过对低温胁迫后紫花苜蓿成活率比较得出，在播种后45 d，温度达到-5℃与-10℃的成活率均低于20%，无法越冬；在播种后60 d，-5℃条件下，4个紫花苜蓿品种的成活率达到了40%左右；在-10℃条件下，“甘农3号”的成活率为28%，而“龙牧801”的成活率为45%，4个紫花苜蓿品种成活率差异显著，这说明4个紫花苜蓿品种在播种后60 d对低温的耐受程度较低，仅有“龙牧801”紫花苜蓿品种能够勉强越冬；在播种后75 d，-10℃条件下，4个紫花苜蓿品种的成活率均达到55%以上，说明4个紫花苜蓿品种可以安全越冬。此外，随着温度的逐渐降低，紫花苜蓿体内的可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸均在播种后75 d的积累量大于在播种后60 d的积累量，这可能是由于紫花苜蓿在播种60 d后，紫花苜蓿体内的抗寒机制尚未完善，而在播种后75 d，紫花苜蓿体内的营养物质积累量更大，使其地上鲜重、根直径、根体积增大，从而积累了脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等物质，完善了紫花苜蓿的抗寒机制。因此，当环境最低温达到-10℃时，4个紫花苜蓿品种在入冬前75 d播种最为安全。

根系是植物吸收、转化和储存养分的重要器官，植物地上部分的发育状况与根系密切相关，进而影响了紫花苜蓿的生产性能[19-20]。已有研究表明，紫花苜蓿安全越冬与其地上生物量、根颈粗细程度显著相关，孙启忠认为冬季来临之前，紫花苜蓿的主根直径达到3 mm就能安全越冬[21-24]。本研究中，利用Pearson相关系数法对4个紫花苜蓿品种的成活率与其株高、鲜重(地上)、根重和根体积进行相关性分析，发现4个紫花苜蓿品种的单株鲜重、主根直径、根重和根体积与成活率均呈极显著正相关，且地上鲜重及根体积、主根直径对其越冬率影响最为显著，这与王运涛等[20]对不同苜蓿品种根系形态特征研究中发现紫花苜蓿的主根直径与成活率呈显著相关的规律相似。由于品种之间的差异，“龙牧801”紫花苜蓿品种的根重、根体积显著高于其它紫花苜蓿品种，这可能是由于抗寒性强的紫花苜蓿品种会随着温度降低其地上部分生长缓慢甚至停止，并且植物所储藏的营养物质部分还会从地上向地下转移[23]。而“WL343”紫花苜蓿品种地上鲜重与株高的增长速度均高于其它紫花苜蓿品种，其根重和根体积仅次于第一的“龙牧801”，又根据本试验紫花苜蓿成活率与生长特性相关性的结果可知，“龙牧801”与“WL343”紫花苜蓿品种均具有较强的抗寒性。

诸多研究表明，相对电导率、丙二醛、游离脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均可作为评价苜蓿品种抗寒性的重要生理指标[25-27]。Lyons认为，当植物受到低温胁迫时，细胞膜的透性会增大，电解质会不同程度的渗漏，导致细胞膜系统损坏[28]。丙二醛作为细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它的产生会使植物的细胞膜系统受到不同程度的损伤，而大量糖类物质能提高植物细胞的渗透势，保护细胞的稳定性[29-30]。本研究表明，“龙牧801”与“WL343”在低温胁迫后的丙二醛含量均低于其它苜蓿品种，可溶性糖含量与游离脯氨酸含量均高于其它紫花苜蓿品种，表明“龙牧801”与“WL343”苜蓿品种抗寒性能优良。李倩等[31-32]研究认为抗寒性与丙二醛含量呈负相关，与可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸含量与抗寒性呈显著正相关。本试验通过对7项形态指标与5项生理生化指标进行隶属函数综合分析，得出了4个紫花苜蓿品种综合抗寒性顺序：“龙牧801”>“WL343”>“WL298”>“甘农3号”，说明“龙牧801”与“WL343”紫花苜蓿品种抗寒性较为优良。

4 结论

本研究中，通过相关性分析与隶属函数综合评价得出“龙牧801”的抗寒综合表现最佳，“WL343”次之。在模拟越冬-5℃和-10℃条件下，4个紫花苜蓿品种在播种后生长45 d时成活率均极低；在生长60 d时的成活率除“龙牧801”以外，其它3个品种成活率均低于50%，在生长75 d时在-5℃和-10℃条件下的成活率均高于55%。因此，西北地区秋播紫花苜蓿在入冬前至少保证75 d的生长时间越冬最为安全，对于某些抗寒品种如“龙牧801”可适当推迟秋播时间，但也应在入冬前60 d之前播种。