TGF-β3诱导牙源性干细胞修复牙槽骨缺损的研究进展

唐青霞 综述 赵月萍 审校

暨南大学口腔医学院，广东 广州 510632

如何促进牙槽骨缺损的修复是临床上关注的热点。目前，临床上针对牙槽骨的修复再生主要是通过骨移植、引导性骨再生等方法，但这些方法因手术适应证不同、手术技术的复杂程度不同而表现出其固有的局限性[1]。以组织工程学为基础的治疗策略，为当前的研究热点，包括生长因子、种子细胞、生物支架，为牙槽骨修复提供新的治疗策略[2-3]。转化生长因子-β3(transforming growth factor-β3，TGF-β3)是转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成员之一，已有实验证据表明，TGF-β3不仅仅是软骨组织工程的理想细胞因子之一，其可以通过软骨内骨化途径促进骨内修复[4]。本文对TGF-β3在诱导牙源性干细胞成骨分化和相关信号通路方面的最新研究做一综述。

1 TGF-β3生物学功能和应用

外源性生长因子在骨组织再生过程中发挥着重要作用。TGF-β作为一种重要的骨生长调控因子，同时促进成骨细胞的生长和抑制破骨细胞的形成。转化生长因子是一种具有多种生物学功能的多肽生长因子超家族，它在各种生理病理中起着重要作用，例如细胞生长和分化、基质形成、机体免疫、损伤修复、软骨和骨的形成、免疫调节等。TGF-β家族可分为许多亚家族，其中TGF-β亚家族包括了TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，三种TGF-β之间的核酸序列具有高度的同源性[5]。实验研究表明，TGF-β3与骨形态蛋白联合后在诱导成骨细胞分化时的双向调控作用更加持久[6]。

TGF-β3已在体内用于软骨修复、组织再生和伤口愈合[7-9]，并促进基质形成、免疫和维持干细胞特性[10]。TGF-β3能促进MSCs向增殖和早期分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞[5]。TGF-β3能诱导软骨内骨形成[11]，并完成骨重建[12]，也可招募内源性MSCs启动骨再生[13]。近几年来，TGF-β3逐渐被用于诱导牙源性间充质干细胞的实验研究，因此，TGF-β3可被认为是修复牙槽骨缺损的选择性生物活性分子。

2 TGF-β3诱导牙源性干细胞成骨分化的作用

牙源性干细胞包括了牙周来源的间充质干细胞和牙髓来源的间充质干细胞，被认为是骨再生过程中的关键细胞。牙源性干细胞在牙槽骨损伤修复中表现突出，是优于其他体细胞来源的干细胞[14]。牙源性干细胞被定义为具有自我更新能力和多向分化潜能。其中，牙髓干细胞和牙周膜干细胞因临床潜力大而被广泛用于骨再生的体内外实验研究。在适宜的诱导条件下可以分化成为多种组织细胞，包括成牙本质细胞、成软骨细胞、成骨细胞、血管内皮细胞和心肌细胞等，是口腔组织工程及再生医学领域中最重要的种子细胞[15]。TGF-β3对牙源性干细胞的诱导作用主要以成软骨向和成骨向两个方向为主[16]。

麦麦提依明·哈力克等[17]研究表明，TGF-β3与肝素联合作用，可在无支架材料环境中可促进牙髓干细胞成骨方向的分化，并可以防止TGF-β3受蛋白酶水解及化学性失活，从而保护其活性，并能发挥更好的生物学作用。并发现在恒定磁场(static magneticfield，SMF)作用下，能提高牙髓干细胞氧代谢水平，形成了高浓度氧代谢环境，从而增强了TGF-β3对牙髓干细胞的体外诱导分化能力[18]。王腾等[19]将牙髓干细胞联合外源性TGF-β3置于兔骨缺损区，增强了成骨细胞的生长分化和增殖效率，并能加速新骨形成。一项体外实验研究表明，TGF-β3在实验浓度范围内对牙周膜干细胞增殖没有影响，但能促进其成骨分化。将其负载与壳聚糖海绵上可以有效的促进牙周膜干细胞成骨向分化[4]，其相关治疗机制及在构建牙槽骨骨修复材料方面仍在深入研究中。

3 TGF-β3诱导牙槽骨修复的成骨方式

骨损伤的修复方式包括膜内成骨和软骨内成骨。膜内成骨方式是先由间充质分化成为胚性结缔组织膜，然后在该膜中骨化。在整个骨修复过程中没有软骨骨痂的生成，而是直接由干细胞分化成熟为成骨细胞，成骨细胞分泌骨基质将缺损修复。软骨内成骨的骨修复过程如下，首先由软骨细胞增生肥大，软骨基质钙化，致使软骨细胞退化死亡，随着软骨和骨细胞的侵入，新生血管长入，骨祖细胞形成成骨细胞并分泌钙化的软骨基质，从而最终完成骨的修复过程。

UGO RIPAMONTI教授团队开展TGF-β3在牙骨质和骨发育形成中的功能研究已有将近20年的历史，从2006年至今在《Biomaterials》等发表了多篇高水平的研究论文[20-21]，而且一直在持续更新进展。除此，在灵长类动物狒狒下颌第一、第二磨牙牙周骨缺损模型也证实TGF-β3显著诱导了骨的形成[22]。但相关理论和机制并没有得到清楚的解释和阐述，从动物实验到人的应用还有许多待解决的科学问题。在对异位骨化(HO)疾病的研究中发现，TGF-β3可能是HO的诱因，而HO是通过软骨内骨化发生发展起来的。其可能机制是：首先免疫细胞在受损部位聚焦释放TGF-β3，然后软骨细胞增殖、肥大并矿化；此后活性的TGF-β3招募MSPCs与Nestin+的H型血管共同促进了新生骨的形成[23]。2020年新发表在Nature的文章对血管缺乏涉及的脂质代谢和骨骼祖细胞的命运进行了深入探讨，指出微小血管的形成及营养运输对软骨内成骨非常重要，该文章为软骨内成骨的机制研究提供了新的证据[24]。这些研究表明，TGF-β3诱导软骨内骨化途径可能刺激体内骨的形成。现有技术手段和理论认为牙槽骨主要通过膜内成骨的方式进行成骨，TGF-β3诱导骨再生机制属于“软骨内成骨”，应用TGF-β3进行牙槽骨再生修复将是一种新的研究策略。

4 TGF-β3诱导牙槽骨修复的信号通路

转化生长因子-β超家族信号在多种生物系统中调控细胞生长、分化和发育中发挥重要作用。在成骨分化和骨再生过程中，TGF-β3介导的信号转导特异性通过典型的Smad依赖通路(TGF-β配体、受体和Smad)和非典型的Smad独立信号通路(如p38 MAPK通路)发生[25]。

4.1 TGF-β3受体与信号转导 目前已明确TGF-β3的特异性受体有Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅰ型受体和Ⅱ型受体都属于丝氨酸/苏氨酸激酶受体，Ⅱ型受体决定受体的反应特异性。在无Ⅰ型受体的情况下，Ⅱ型受体主要与TGF-β1和TGF-β3高亲和力结合，而不与TGF-β2结合[26]。Ⅲ型受体本身不参与信号传导，作为一种辅助受体，间接调节TGF-β1与受体结合的过程。近期报道中，评估了可溶性转化生长因子β受体3(TgfβR3)在诱导人骨源性成骨细胞样细胞增加矿化中的作用，证实了TgfβR3信号可诱导骨前体成骨[27]。Smad蛋白是TGF-β家族受体下游的信号转导分子。根据在TGF-β信号转导中的功能差异，其被分为三类：包括受体调控型或通路限制型(R-Smad)：Smad1/2/3/5/8；共同通用型(Co-Smad)：Smad4；抑 制 型(I-Smad)：Smad6/7[26]。通常来说，信号转导始于配体诱导的丝氨酸/苏氨酸受体激酶的寡聚化，以及TGF-β/激活素途径中的细胞质信号转导分子Smad2/3和骨形态发生蛋白(BMP)途径中的Smad1/5/9磷酸化[28-30]。在公认的TGF-β诱导Smad激活后，导致Smad介导基因表达的模型中：TGF-β二聚体与Ⅱ型TβRII结合，导致TβRI募集到异构体受体复合体中，使TβRI的GS结构域转磷酸化。随后激活的TβRI通过C-末端丝氨酸的磷酸化激活Smad2和Smad3，这些受体激活的R-Smads与Smad4结合，形成Smad三聚体进入细胞核，并与靶基因Smad结合的调控DNA序列上的其他辅助转录因子结合，从而直接激活或抑制靶基因的表达[31]。

4.2 TGFβ-Smads信号通路 TGFβ-Smads信号通路促进骨祖细胞增殖、趋化和早期分化。同时，它也抑制成骨细胞的成熟、矿化和向骨细胞过渡。通过降低RANKL/OPG分泌比例抑制破骨细胞分化，但通过直接结合破骨细胞上的受体促进破骨细胞发生。Smad2和Smad3具有双向调节转化生长因子-β介导的成骨细胞分化和软骨细胞内骨化。Smad2/3抑制Runx2的表达，激活的Smad3也招募Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶(HDACs)4和5来抑制Runx2的功能，在缺乏Smad3的情况下，TGF-β不能再抑制成骨细胞的分化[32-34]。TGF-β-Smad3虽然负调控成骨细胞的发生，但也抑制成骨细胞凋亡和向成骨细胞分化[35]。因此，Smad3缺失大鼠的骨质减少与骨细胞数量增加和细胞凋亡相关。成骨细胞受到机械力刺激时细胞数目增加，同时TGF-β的表达亦增加。在大鼠腭中缝牵张成骨实验中，验证了在应力刺激下成骨细胞TGF-β1、TGF-β2的高表达使其增殖指数上升，而TGF-β3呈低表达状态。Smad4作为唯一的通用型Smad分子，是TGFβ信号通路的中心介导者。TGF-β3在体外促进rDPSCs的成骨向分化实验中，不同时间点Smad4呈高表达趋势，但Smad2/3复合物及相关Smad蛋白是否参与到TGF-β3诱导的rDPSCs成骨还尚未见报道[36]。

4.3 TGFβ-p38MAPK信号通路 p38MAPK(α、β、γ和δ)是MAPK家族的成员，各种环境应激和炎症细胞因子均可将其激活。多项研究表明，PDLSCs通过p38MAPK信号通路进行成骨分化[37-39]。研究发现，在TGF-β3诱导PDLSCs后，TGF-β3与TβRⅠ/Ⅱ受体结合后，启动p38磷酸化后入细胞核促进RUNX2的表达，从而促进hPDLSCs的成骨分化，但其上下游分子机制不明[4]。RUNX2在协同参与成骨细胞分化的多种信号方面发挥重要作用，是成骨分化和骨形成所必需的特异性转导调控因子，也是细胞成骨分化过程中最早持续表达的蛋白，标志着成骨分化的开始。TGF-β3诱导牙源性干细胞成骨分化的p38 MAPK信号通路，多数学者认同以下观点：TGF-β3激活特异性Ⅰ型、Ⅱ型受体并与之相互作用，形成受体复合物，并将信号传导到细胞内，使得细胞内的TAK1被激活，TAK1再激活并磷酸化MKK3/6，进一步激活下游的P38MAPK，后者可直接进入细胞核，从而磷酸化激活RUNX2，影响细胞因子的释放并上调相关的成骨相关基因表达，促使干细胞成骨分化。

5 结语

牙槽骨缺损修复是临床上最常见的棘手问题，对于牙槽骨的功能性保存与修复再生是十分必要的。转化生长因子家族在骨组织工程修复中起着重要的作用，大量实验证实了TGF-β3具有促进骨软骨细胞软骨分化的能力，是软骨组织工程的理想细胞因子之一。将TGF-β3作为牙槽骨修复的细胞因子，是骨向修复而不是软骨，突破了TGF-β3惯常的理论，将是一种新的策略。本文分析了TGF-β3能诱导的牙源性干细胞成骨分化的作用以及两条重要途径——Smads信号通路和p38MAPK信号通路，但是在其他信号通路的作用及相关通路之间的联系目前尚不清楚。TGF-β3用于与牙槽骨缺损修复的应用研究的相关理论和机制并没有得到完全清楚的解释和阐述，从动物实验到人的应用还有许多待解决的科学问题，可望形成新的治疗策略，为骨组织工程的研究提供新思维。