耐（抗）柑橘黄龙病种质材料的评价研究*

武晓晓，娄兵海，唐 艳，陈传武，刘 萍，章慧璇，范七君，黄俊源，门友均，邓崇岭

（1 广西特色作物研究院，广西柑橘育种与栽培工程技术研究中心，桂林541004）（2 广西师范大学生命科学学院）

柑橘黄龙病是一种世界性的柑橘毁灭性病害，主要通过柑橘木虱、嫁接、带病的苗木传播，也可以通过菟丝子传播，每年对我国柑橘产业造成的经济损失有数十亿元。柑橘黄龙病不但造成很大的经济损失，且其防治也非常困难，目前，只能说是可防可控，而无法根治[1-3]。众多科研院所经十几年研究，仍未搞清楚其致病机理，主要障碍在于病菌不能培养和缺少抗病品种[4-8]。

广西的柑橘黄龙病出现于20 世纪30 年代，其发生历史已近1个世纪，广西中部和南部20 世纪七八十年代发展起来的柑橘园几乎全部毁于柑橘黄龙病，面积超过6.67 万hm2，直接经济损失超过100 亿元[9-10]。由于柑橘黄龙病在广西发生历史久，发生面广，损失惨重，感病树基数大，因此，从中获得耐柑橘黄龙病种质材料是有可能的。

课题组在2012—2020 年调查中发现，在少数果园有个别柑橘植株存活30～50 年，生长结果正常，而周边柑橘植株被黄龙病毁掉2～3 代；还有已感染黄龙病10～20 年的柑橘树，个别枝条生长结果正常，表明在田间可能也存在耐黄龙病的柑橘植株变异资源，这些变异资源是解析致病机理、寻找抗病基因[10-12]的宝贵资源。因此，筛选出对柑橘黄龙病具有耐性的柑橘种质材料，并在生产上推广应用，是解决柑橘黄龙病危害最根本的途径，对柑橘产业健康可持续发展具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为广西壮族自治区范围内的野生柑橘种质资源和疑似耐（抗）柑橘黄龙病柑橘种质材料。

1.2 试验方法

1.2.1 疑似耐（抗）柑橘黄龙病种质材料收集、选种及鉴定方法

2012—2020 年，在广西壮族自治区范围内对野生柑橘种质资源和田间疑似耐（抗）柑橘黄龙病的种质材料进行选种和收集，选种及收集时期为整个柑橘生长季，重点在秋、冬季柑橘黄龙病病症表现期。

1.2.2 疑似耐（抗）柑橘黄龙病柑橘种质材料的保存

课题组对筛选出的疑似耐（抗）柑橘黄龙病柑橘种质材料，通过嫁接的方式进行扩繁，种植在塑料桶里进行保存，建立耐（抗）柑橘黄龙病柑橘种质材料保存圃。

1.2.3 疑似耐（抗）柑橘黄龙病柑橘种质材料的高接染毒鉴定法

（1）高接。在果园中选取已经感染黄龙病的柑橘树，进行定性PCR 检测加以确定。高接方法主要为春接，春接时间为2—4 月，高接方式为单芽切接，在高接树上选取直径0.5 cm 以上的枝条，从树皮平滑处剪断，在枝条断面下方沿皮层与木质部交界处向下纵切1 刀，露出形成层，切面要短于接穗芽，然后从待鉴定的种质材料的枝条上切取单芽，再插入中间砧枝条切口上，对准形成层并用嫁接膜绑缚。

（2）田间症状观察。高接4个月后，根据待鉴定的种质材料抽出的枝梢的症状来进行诊断：枝梢生长良好、无黄梢、无斑驳型黄化叶片或仅有轻微叶片黄化症状，则初步判定该种质材料对柑橘黄龙病具有耐性；枝梢生长较弱、黄梢严重、叶片斑驳型黄化症状明显，则初步判定该种质材料对柑橘黄龙病不具有耐性。

（3）实时荧光定量PCR 检测。采集高接成活且初步判定为耐柑橘黄龙病种质材料的叶片，采用改良CTAB 法[13]提取叶脉DNA，得到待测样品的DNA 模板；从健康柑橘树的叶脉中提取DNA，作为阴性对照；从柑橘黄龙病树的叶脉中提取DNA，作为阳性对照；参照Li 等[14]报道的方法进行实时荧光定量PCR 扩增，绘制标准曲线，并建立标准曲线方程，计算病原菌含量。

2 结果与分析

2.1 疑似耐（抗）柑橘黄龙病种质材料的收集

本研究共收集疑似耐（抗）柑橘黄龙病种质材料177 份，其中野生柑橘资源19 份（表1）；田间疑似耐（抗）柑橘黄龙病种质材料158 份（表2），包括‘砂糖橘’25 份、‘沙田柚’29 份、椪柑65份、橙类19 份、‘桂橘一号’5 份、温州蜜柑10份、‘蜜广橘’2 份、‘南丰蜜橘’1 份及其他柑橘材料2 份。

2.2 疑似耐（抗）柑橘黄龙病种质材料的PCR 检测

对收集到的177 份疑似耐（抗）柑橘黄龙病种质材料进行PCR 检测，如表1、表2 所示，检测结果均为阴性，表明这些单株（材料）均未感染黄龙病菌。

表1 野生柑橘种质材料收集情况及检测结果

续表2

2.3 疑似耐（抗）柑橘黄龙病种质材料的保存

对筛选出的177 份疑似耐病材料通过嫁接的方式进行扩繁，种植在塑料桶内进行保存，建立耐（抗）柑橘黄龙病种质材料保存圃1个（图1），可以满足后续高接鉴定以及其他相关试验的需要。

图1 疑似耐（抗）柑橘黄龙病种质材料保存圃

2.4 疑似耐（抗）柑橘黄龙病种质材料的鉴定

2.4.1 田间症状观察

分别于2018 年3 月和2019 年3 月对收集、保存的疑似耐（抗）柑橘黄龙病种质材料进行高接染毒鉴定（图2），高接成活4个月后田间黄龙病典型斑驳型叶片黄化症状明显（图3），对待鉴定材料进行黄龙病田间症状观察和统计，经观察发现部分材料没有表现黄龙病症状，与其他材料相比表现出了耐病性。

图2 高接染毒鉴定试验

图3 田间黄龙病叶片黄化症状

2.4.2 黄龙病PCR 检测

在观察待鉴定材料田间症状的同时采集样品，进行定性/定量PCR 检测，结果表明部分材料感染黄龙病（检测结果为阳性）时间较晚，例如阳性对照在高接5个月后（2019 年8 月）检测到已感染黄龙病，KH-9、KHY-2 在高接8个月后（2019 年11月）才检测到，GCC-8 甚至在高接11个月后（2020年2 月）才检测到（表3）。

表3 部分种质材料不同时期定性PCR 检测结果

感染黄龙病后，对待鉴定材料和阳性对照进行黄龙病菌定量检测，结果显示KHY-2 植株内的黄龙病菌平均含量为123 520.0个细胞/μg DNA，而阳性对照植株内的黄龙病菌平均含量为3 623 351.0个细胞/μg DNA，KHY-2 中的黄龙病菌含量始终明显低于阳性对照（图4）。

图4 KHY-2 种质材料不同时期黄龙病菌含量

经过2 年的试验研究，共筛选出16 份耐柑橘黄龙病的种质材料，其中包括野生柑橘材料4 份、田间耐病材料12 份（表4）。

表4 耐柑橘黄龙病的种质材料

3 讨论与结论

从1919 年黄龙病首次被报道至今，关于柑橘和柑橘近缘种对黄龙病的抗性或耐受性的报道屡见不鲜。Vand 等[15]通过嫁接试验鉴定了15个柑橘品种对黄龙病的耐病能力，依据表现出的症状可以将它们分为5 组：重症组、中症组、轻症组、耐病组和抗病组。Stover 等[16]对受黄龙病严重影响的佛罗里达州的主要商业化柑橘品种进行了耐病评价。其中‘Temple’表现出的HLB 症状最轻，而‘默科特’和‘米尼奥拉’的症状最明显。‘Sugar Belle’橘和‘Bearss’柠檬与其他品种相比对黄龙病具有显著的耐病能力[17]。滕彩玲等[18]研究发现，‘马蜂柑’具有较强耐病性，且其作为中间砧亦可显著延缓甜橙的发病时间。枳与‘印度野橘’杂交后代‘US-897’接种黄龙病菌后没有明显感病症状，果实生长正常，树体生长几乎不受影响[19]。以上研究都表明，不同的柑橘品种对黄龙病表现的耐病性存在很大的差异。

本研究通过大田株选的方法，对广西壮族自治区内的疑似耐（抗）柑橘黄龙病种质材料进行选种、收集和保存，共收集和保存疑似耐（抗）柑橘黄龙病材料177 份，其中野生柑橘材料19 份，田间疑似耐（抗）柑橘黄龙病种质材料158 份，建立耐（抗）柑橘黄龙病种质材料保存圃1个，并通过高接染毒法对这些材料进行鉴定，结合田间黄龙病症状观察与定性/定量PCR 检测结果，共筛选出16 份对柑橘黄龙病表现耐性的种质材料，其中野生资源4 份，田间耐病材料12 份。耐柑橘黄龙病材料的具体表现为：①与同时期高接染毒的材料相比，感染黄龙病的时间较晚，即检测到黄龙病菌的时间较晚；②感染黄龙病后，植株表现较为正常，黄龙病症状不明显；③感染黄龙病后，经过定量PCR 检测显示，植株体内黄龙病菌含量显著低于其他材料。本研究采用高接染毒鉴定法对疑似耐（抗）柑橘黄龙病种质材料开展黄龙病的耐性鉴定和评价工作，为柑橘的抗病育种奠定了理论和实际基础。