高产漆酶菌株的筛选、鉴定和固态发酵条件优化

李彩联 郭艳丽 张铁鹰 王丽华 高爱琴

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193；3.内蒙古农业大学动物科学技术学院，呼和浩特 010018)

能量饲料资源短缺限制了我国养殖业平稳发展[1-2]。秸秆等农业副产物和麸皮等粮食加工副产品中均含有丰富的纤维素和半纤维素，具有较强供能潜质。若能将其高效水解利用，对缓解能量饲料供需矛盾具有重要意义。不仅纤维素本身结晶结构影响了纤维水解酶的水解效率，同时木质素对纤维素的包埋作用阻碍了纤维水解酶与之结合，进一步增加了高纤维饲料利用难度[3-4]。因此，消除纤维类饲料中木质素是高效利用纤维的主要环节之一。与此同时，木质素也是玉米、大豆等籽实植物细胞壁结构的成分，降解其中的木质素成分、破坏细胞壁结构、快速释放胞内养分，可以提高能量和营养物质的利用效率。

木腐真菌通过菌丝或菌丝体在木材内蔓延，菌丝顶端可分泌漆酶等氧化酶来氧化破坏木质素结构，导致木材腐朽[5]。漆酶是一种含铜多酚氧化酶[6-7]，广泛分布于高等植物[8]、真菌[9-10]和细菌中[11-12]，通过攻击木质素中酚类化合物来实现对木质素的降解[13-15]。漆酶对破坏植物性饲料中木质素结构，提高饲料利用率具有重要意义[16-18]。目前，产漆酶木腐真菌主要包括白腐菌、褐腐菌和软腐菌[19]。其中，白腐菌降解木质素的能力最强[20-22]，常见白腐菌主要包括杂色云芝、血红密孔菌、变色栓菌、黄孢原毛平革菌等[23]。这些真菌在自然环境条件下通常生长速度慢，产漆酶活性也普遍较低[24-25]，无法满足实际生产需求。因此，本研究拟通过对多株木腐菌进行平板显色筛选，获得高产漆酶菌株，并采用单因素试验和正交试验对其固态发酵产漆酶条件进行优化，提高其产酶活性，以期达到可用于改善饲料利用率的目的。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

试验共选择33株白腐菌和褐腐菌，均购自中国工业微生物菌种保藏中心。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)：200 g马铃薯，20 g葡萄糖，20 g琼脂，1 L去离子水。

愈创木酚-PDA培养基：在PDA培养基中加入质量体积比为0.04%的愈创木酚。

种子培养基：麸皮1%，磷酸二氢钾0.3%。

固态发酵培养基：麸皮10 g，磷酸二氢钾0.5%，初始含水量50%。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株活化及传代

将33株白腐菌和褐腐菌菌株先接种至平面PDA培养基上，在30 ℃恒温培养箱中倒置培养5 d。

1.2.2 菌株初筛

将纯化后的33株白腐菌和褐腐菌菌株再次接种至愈创木酚-PDA培养基上，30 ℃倒置培养72 h。愈创木酚是漆酶的特征底物，菌株生长过程中产生的漆酶会将愈创木酚氧化成红棕色，菌株生长越快，变色圈越大，漆酶活性越高，变色圈越深。因此，根据红棕色变色圈大小及颜色深浅确定初筛菌株。

1.2.3 菌株复筛

1.2.3.1 种子液制备

选取平面PDA培养基上干净菌丝块，放入装有100 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、160 r/min振荡培养96 h。

1.2.3.2 固态发酵培养

在固态发酵培养基中，种子液接种量为10%，30 ℃恒温培养不同时间，测定漆酶活性进行复筛。不同菌株发酵时间根据菌种生长状态和菌丝密集程度确定。每个菌株6个平行。

1.2.3.3 漆酶活性测定

准确称取0.50 g均质固态发酵样品于50 mL离心管中，加入20 mL pH 4.5琥珀酸-氢氧化钠缓冲液，30 ℃、120 r/min浸提30 min，4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液测定漆酶活性[26-27]。

1.2.4 菌株平板生长特性

将高活性菌株接种于固体PDA培养基中，30 ℃倒置培养，待菌落长出后，观察其菌落生长状态。

1.2.5 18S rDNA菌种鉴定

根据Omega-D3390 Fungal DNA Mini Kit试剂盒说明书操作步骤提取复筛菌株基因组DNA，通过PCR扩增，合成引物，获得18S rDNA部分序列，进行BLAST序列比对，构建系统进化树。

1.3 发酵条件对漆酶活性的影响

分别对培养基接种量、含水量、通氧量、发酵时间4个因素进行单因素试验，确定适宜发酵条件，每个处理6个平行。

1.3.1 接种量对漆酶活性的影响

在固态发酵培养基中，将种子液接种量分别设置为1%、5%、10%和20%，30 ℃培养150 h，测定漆酶活性。

1.3.2 含水量对漆酶活性的影响

在固态发酵培养基中，将培养基的含水量分别设置为50%、55%、60%和65%，30 ℃培养150 h，测定漆酶活性。

1.3.3 通氧量对产漆酶的影响

在固态发酵培养基中，将培养基的通氧量分别设置为0、10%、20%和30%，不同比例通氧量用含有不同数量5 mm透气孔的封瓶膜封住瓶口，1个5 mm透气孔代表10%通氧量，30 ℃培养150 h，测定漆酶活性。

1.3.4 发酵时间对产漆酶的影响

在固态发酵培养基中，将培养基的发酵时间分别设置为90、102、114、126、138、150 h，30 ℃培养，测定漆酶活性。

1.3.5 正交试验

根据单因素试验结果，以培养基接种量、含水量、通氧量和发酵时间4个因素为试验因子，设计4因素3水平L9(34)正交试验，选出最优条件，每个处理6个平行。

1.4 数据统计与分析

运用SPSS 19.0统计软件，进行单因素差异显著性方差分析，采用Duncan氏法进行组间多重比较。结果用平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 高产漆酶菌初筛

通过愈创木酚-PDA培养基对33株菌株进行培养，各菌株产红棕色氧化圈情况见图1。由图可知，21、24、27、29、30、31号这6株菌株无漆酶活性，2、3、4、6、7、8、9、10、11、14、15、18、19、25、26、32、33号这17株菌株的红棕色氧化圈大且颜色深，故对这17株菌进行固态发酵与酶活性测定复筛。

图1 高产漆酶菌株初筛Fig.1 Preliminary screening of high-yield laccase strains

2.2 高产漆酶菌株复筛

在复筛过程中，32号菌株发酵全程无菌丝，可能未生长，无漆酶活性。由表1可知，17个复筛菌株中14号菌株漆酶活性最高，达2 029.49 U/g；25号菌株次之，漆酶活性达1 865.95 U/g，二者酶活性无显著差异(P>0.05)；但相比25号菌株，14号菌株发酵时间较长，故选择25号菌株对其固态发酵条件进行优化。

表1 高产漆酶菌株复筛Table 1 Re-screening of high-yield laccase strains

2.3 菌株平板生长特性

25号菌株平板生长情况如图2所示，25号菌株在PDA平板上生长较快，5 d可长满整个平板，菌丝洁白，边缘呈放射状，菌落具有明显的同心圆特征(图2-A)。菌株经愈创木酚-PDA显色，菌落周围及底部有红棕色变色圈产生(图2-B)。

图2 25号菌株形态特征(A)、筛选平板变色圈(B)Fig.2 Morphological characteristic (A)and screening plate color zone (B)of strain 25

2.4 高产漆酶菌株鉴定

通过BLAST比对，发现25号菌株与灵芝属GI-16(GanodermalucidumGI-16)序列的相似性高达99.59%。根据BLAST比对结果，取相似度较高的序列构建系统进化树(图3)。对系统进化树分析可知，25号菌株与灵芝属菌株最为相似，故确定25号菌株为灵芝属。

图3 基于18S rDNA基因序列对25号构建的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of strain 25 based on 18S rDNA gene sequence

2.5 产漆酶发酵条件优化

2.5.1 接种量对漆酶活性的影响

由表2可知，接种量为5%时漆酶活性最高，为3 111.53 U/g，继续增加接种量，漆酶活性逐渐下降，接种量为20%时漆酶活性显著低于接种量为5%和10%时(P<0.05)。这说明过高的接种量不利于该菌分泌漆酶，接种量5%较为适宜。

表2 接种量对漆酶活性的影响Table 2 Effects of inoculation amount on laccase activity U/g

2.5.2 含水量对漆酶活性的影响

由表3可知，培养基中漆酶活性随着含水量增加先升高后降低，含水量为60%时，漆酶活性最高，为3 111.53 U/g，显著高于含水量为50%、55%和65%时(P<0.05)。这说明含水量对漆酶活性影响较大，含水量过高可影响菌体通氧量，导致漆酶活性降低。

表3 含水量对漆酶活性的影响Table 3 Effects of water content on laccase activity U/g

2.5.3 通氧量对漆酶活性的影响

由表4可见，当用无孔封瓶膜将瓶口封住(即通氧量为0)时，菌株生长受限，漆酶活性受到严重抑制。随着通氧量增加，漆酶活性呈先升高后降低的变化趋势，且通氧量为10%时的漆酶活性显著高于其他通氧量(P<0.05)。这说明通氧量是影响固态发酵产酶的重要因素，通氧量对固态发酵产漆酶有较大影响，过低和过高的通氧量均不利于漆酶分泌。

表4 通氧量对漆酶活性的影响Table 4 Effects of oxygen content on laccase yield U/g

2.5.4 发酵时间对漆酶活性的影响

由表5可见，随着发酵时间延长，漆酶活性快速提高，并于发酵时间为114 h时达到最高，随后漆酶活性呈逐渐下降趋势。这可能是随着发酵时间的延长，漆酶代谢产物积累，反馈抑制了漆酶的分泌，同时漆酶在此固态培养基条件下的稳定性较差也是导致漆酶活性降低的原因。发酵时间为102和114 h时漆酶活性无显著差异(P>0.05)，且显著高于其他发酵时间(P<0.05)。故以发酵时间114 h为宜。

表5 发酵时间对漆酶活性的影响Table 5 Effects of fermentation time on laccase activity U/g

2.6 正交试验

对培养基适宜接种量、含水量、通氧量、发酵时间4个因素，进行4因素3水平的正交试验，结果见表6。通过正交试验极差(R)分析，培养基含水量对漆酶活性起决定性作用，发酵时间次之，接种量和通氧量对产漆酶活性影响较小。

表6 正交试验结果与分析Table 6 Orthogonal test results and analysis

2.7 正交试验结果验证

由表7可知，验证结果与正交试验结果一致，最适发酵条件为接种量5%、含水量62.5%、通氧量15%、发酵时间120 h，漆酶活性达9 522.22 U/g，较优化前(3 111.53 U/g)提高了2.06倍。

表7 结果验证Table 7 Result verification

3 讨 论

利用成本低廉的天然有机原料为基质进行固态发酵，具有操作工序简单、节能和供氧更充足等优点，较适合于丝状真菌生长。固态发酵也存在养分流动性差、发酵散热不良和无法持续补充养分等缺点。因而，科学优化固态发酵工艺参数对提高发酵产物的产量至关重要。本研究筛选获得了1株灵芝属高产漆酶菌，属于丝状真菌类，在自然界中主要生长在固态基质中。本研究采用固态发酵方法模拟其自然生长状态，并优化其产漆酶的最优固态发酵参数，以期满足实际生产应用的需要。

接种量大小会直接影响菌种在培养基中的发酵速度和产酶效率。本研究结果显示，该灵芝属菌产漆酶适宜接种量为5%，而血红密孔菌[29]、云芝[30]和变色栓菌[31]产漆酶适宜接种量分别为4%、10%和10%，与本研究结果存在一定差异。这可能与不同菌种之间的生长特性以及培养基的组成有关。高接种量虽然可以缩短菌丝繁殖达到高峰的时间，减少杂菌生长机会，但也会造成养分消耗过快、产热积累集中或溶氧不足等问题，进而影响漆酶合成。过低接种量会导致发酵周期延长、生产效率降低和杂菌污染等风险。本研究结果也证明了这一点，当接种量高于5%时，漆酶活性逐渐降低。这说明在本试验条件下过高接种量不利于该菌株分泌漆酶。

固态发酵基质内适宜含水量既有利于营养物质的溶解与传递，且使基质呈松散状态，又有助于通氧和散热。高恩丽[30]和张树江[32]报道的云芝固态发酵，产漆酶培养基适宜含水量为65%；江义[33]报道的栓菌属FA-J1培养基含水量为70%；而孙珂[31]报道的变色栓菌漆酶培养基含水量为83.57%。本研究的灵芝属菌产漆酶培养基适宜含水量为62.5%。这说明不同菌种固态发酵，产漆酶对培养基中含水量需求不尽一致。此外，本研究以麸皮为主要发酵基质，而高恩丽[30]、孙珂[31]和张树江[32]以玉米皮与麸皮混合物、玉米皮和茶渣为发酵基质。不同基质间持水力不同，也可能是导致菌株间发酵培养基含水量需求存在差异的原因。

微生物生长代谢越旺盛，其代谢产物积累越快。好氧生物发酵过程中，通常以加大通氧量的方式来提高微生物生长代谢速度。漆酶是一种氧化还原酶，需在氧的参与下才能发挥其作用。本研究发现，适度限制试验菌株发酵过程中的通氧量可增加漆酶产量。通氧量过低时，菌丝生长速度明显减慢，使得菌丝稀疏且纤细，进而影响其漆酶分泌。通氧量过高时，可能会加快漆酶氧化木质素的速度，氧化产物过度积累，进而反馈抑制该菌株漆酶分泌，最终影响漆酶产量。有关通氧量对白腐菌固态发酵产漆酶的影响尚未见相关报道，具体的影响机制尚需进一步深入研究。

漆酶是由白腐真菌分泌的次级代谢产物，其产生主要发生在发酵中后期[30]。本研究结果表明，以麸皮为发酵基质，该灵芝属菌随发酵时间延长，漆酶活性快速升高至峰值后开始下降，发酵时间为120 h时漆酶活性达到最大。赵杰[29]将血红密孔菌漆酶基因转进里氏木霉后，重组漆酶培养96 h时活性达到最大；张树江[32]以玉米皮和麸皮为原料，发酵10 d后云芝产漆酶活性达高峰；Gómez等[34]研究发现，彩绒革盖菌以栗子壳和麸皮为基质，发酵12 d时酶活性达到最大；Meza等[35]研究的朱红密孔菌以木糖渣为载体，最高酶活性出现在发酵14 d；孙荣等[36]研究的杂色云芝发酵8 d酶活性达到最大。这些研究结果表明，不同菌株在不同的培养基中产漆酶适宜发酵时间各异，这一方面与菌株本身生长特性有关，同时也可能与培养基组成和为菌株提供产漆酶养分的效率不同而异。另外，在本研究中还发现，随着发酵时间的延长，漆酶活性出现下降趋势，这说明漆酶在本发酵条件下稳定性较差，过长发酵时间不利于漆酶高产。因此，适宜的发酵时间对提高漆酶产量和发酵生产效率至关重要。

本研究在各发酵参数单因素试验的基础上，通过正交试验及验证试验对灵芝属菌株发酵条件进行优化，将各因素最优水平进行组合后，发酵所产漆酶活性提高了2.06倍。段珺等[37]采用响应面分析法优化长绒毛栓菌产漆酶发酵条件后，漆酶活性提高了1.56倍；甄静等[38]采用单因素试验优化毛栓孔菌XYG422产漆酶条件后，漆酶活性显著提高；冯波等[39]研究的毛栓菌最优产漆酶条件为麸皮2.0%、豆饼粉0.6%、发酵5 d，此时漆酶活性达到最大。以上研究表明，不同方法优化不同菌株产漆酶条件存在一定差异，但漆酶活性均有不同幅度地提高，这说明固态发酵工艺参数间的相互影响对提高漆酶活性至关重要。由此可知，适宜的培养条件更有利于白腐菌高效分泌漆酶。

4 结 论

本试验筛选获得了1株灵芝属高产漆酶菌株。该菌株经发酵条件优化后，漆酶活性达9 522.22 U/g，具有较大应用价值。