幽门螺杆菌无创性分子生物学检测方法研究进展

迟文静， 刘 涛， 刘宜昕， 赵 虎， 张艳梅

（复旦大学附属华东医院检验科，上海 200040）

幽门螺杆菌是一种革兰阴性微需氧菌，感染人体后，可定植在人胃部数十年之久[1]，与慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌等消化系统疾病的发生和发展密切相关，是目前唯一被世界卫生组织定为Ⅰ类致癌原的病原菌[2]。有流行病学研究发现，不同国家和地区幽门螺杆菌感染率不同，发达国家感染率为30%～50%，发展中国家为50%～90%[3]；我国的平均感染率为59%[4]。早期发现和及时干预是预防和控制幽门螺杆菌感染相关消化系统疾病发生与发展的关键。目前，诊断幽门螺杆菌的方法较多，其中培养法、快速尿素酶检测法组织染色法等有创性方法，仅适用于少部分能采集到胃活检组织的患者群体，阳性检出率仅为20%左右，耗时长（1周左右），而且除培养法之外，其他方法均存在着不能同步进行耐药及毒力分析的局限性[5]。

有研究发现，口腔幽门螺杆菌与胃内幽门螺杆菌具有很高的同源性，被称为幽门螺杆菌的第二储存池[6]。口腔内幽门螺杆菌与胃部疾病伴发口腔疾病密切相关，也可能是幽门螺杆菌根除治疗后复发的原因之一[7]。粪便样本也有较高的幽门螺杆菌检出率，且其菌种与耐药表型与胃内的幽门螺杆菌高度一致，尤其在慢性胃病患者抑制胃酸治疗后，胃酸过少可能会增加粪便中幽门螺杆菌的数量[8]。此外，在临床工作中，采集口腔和粪便样本具有方便、无创伤、成本低等优点。随着分子生物学技术的发展和应用，在分子水平评估幽门螺杆菌的遗传信息，可动态监测人体内幽门螺杆菌的感染情况，为临床幽门螺杆菌感染的精准诊疗提供了有效帮助[9]。本文重点介绍幽门螺杆菌无创性分子生物学检测方法的研究进展，并比较多种常规幽门螺杆菌检测方法的利弊。

1 幽门螺杆菌常规检测方法

幽门螺杆菌组织病理切片染色法可在镜下鉴定幽门螺杆菌的同时进行胃黏膜的病理学诊断，准确性较高，但必须通过胃镜采集胃黏膜活检组织，操作繁琐、费时[10]。分离培养鉴定法可将胃黏膜活检组织匀浆后接种在高营养的培养基上进行幽门螺杆菌培养，是鉴定幽门螺杆菌感染的金标准，但幽门螺杆菌培养需要微需氧等苛刻条件，且阳性检出率仅20%左右，培养时间也长达1周，不利于幽门螺杆菌感染的快速诊断[11]。快速尿素酶检测法操作简单、快速、成本低、特异性高，但仅适用于活动性幽门螺杆菌感染；若幽门螺杆菌数量少，或观察时间短、试剂质量不稳定，会影响检测结果，假阴性率较高[12]。13C或14C尿素呼气试验不需通过内镜获取样本，目前主要应用于体检人群或门诊患者，技术要求低、敏感性高，但缺点是特异性相对较低、费用高，且易受抑菌药物和抑酸药物的影响，非幽门螺杆菌尿素酶细菌也可能造成假阳性[13]。血清抗体检测法主要检测血清中幽门螺杆菌IgG/IgM抗体成分，可用于幽门螺杆菌筛查[14]，具有快速、微创和能够分型等优点，但存在窗口期，不能反映现症感染[15]。尿液抗体检测法主要检测尿液中的幽门螺杆菌IgG，该方法敏感性和特异性较高，适合大范围幽门螺杆菌感染的流行性调查[16]。但目前尚没有尿液幽门螺杆菌检测的共识或指南，故该方法未广泛应用于临床。粪便抗原检测也能反映是否感染幽门螺杆菌，目前主要分为以单克隆抗体为基础和以多克隆抗体为基础两大类，其中以单克隆抗体为基础的检测方法准确性更高，该方法也可应用于体检人群的筛查，但不能进行耐药性和毒力分析[17]。以上常规检测方法中，有些方法不能对幽门螺杆菌感染进行实时、快速和无创检测，有些方法不能对幽门螺杆菌的耐药特点或毒力分型进行分析，极大地影响了幽门螺杆菌感染的早期发现和精准治疗。

2 无创性分子生物学方法

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）等分子检测技术有着更高的灵敏度和特异性，根据不同的基因序列设计引物，检测无创性样本中幽门螺杆菌的鉴定基因（16SrRNA、ureC）、毒力基因（cagA、vacAS1、vacA2、vacAm1、vacAm2、glmM、babA、babB）和耐药基因（23SrRNA、rdxA、pbp1A、gyrA），能够动态监测幽门螺杆菌的感染情况[18]，具有快速、经济和实时等优点。

2.1 口腔幽门螺杆菌的分子检测

唾液中含有口腔定植的细菌、病毒、真菌和脱落上皮细胞等，可在口腔中不断产生，且容易自行收集。因此，检测口腔中的幽门螺杆菌成为一种快速、可行的方法。然而口腔中大量快速生长的细菌可能抑制苛养菌的生长，唾液中含有的一些抑菌蛋白，如分泌型IgA、乳铁蛋白、溶菌酶等，使得通过培养方法检测唾液中的幽门螺杆菌几乎不太可能实现。牙菌斑是牢固地黏附在牙齿表面，以黏性基质为基础的细菌性群体，是一种不能通过洗漱去掉的细菌性薄膜[19]；牙菌斑由大量细菌、细胞间物质、少量白细胞、脱落上皮细胞和食物残渣等组成，成分复杂，通过培养的方法检测牙菌斑中幽门螺杆菌的研究极少。PCR通过设计不同引物检测口腔样本中的幽门螺杆菌，使口腔幽门螺杆菌检测得以实现[20]。

2.1.1 口腔幽门螺杆菌分子检测方法和检出率

用不同的方法检测口腔中的幽门螺杆菌，检出率存在较大的差异[21]。实时荧光定量PCR包括TaqMan探针法和染料法2种方法，TaqMan探针法应用更广泛。TaqMan探针法的引物和探针与靶基因的结合都是特异性的，利用这种双重特异性，可以按不同的检测目的进行设计，如评估幽门螺杆菌的数量、测定其毒力基因分型、测定耐药基因[22]。WONGPHUTORN等[23]通过实时荧光定量PCR和半巢式PCR检测了泰国东北部110例无症状感染者粪便和唾液样本中的16SrRNA基因和vacA基因，发现群体感染率为64%，提示实时荧光定量PCR和半巢式PCR具有良好的检测性能；通过7名参与者粪便和唾液样本来源的基因序列构建进化树（该树形成了不同的聚类群），可见幽门螺杆菌在宿主体内有着不同的基因进化特点。实时荧光定量PCR实行完全闭管式操作，避免了因扩增产物检测不同步导致的污染所产生的假阳性，扩增产物和信号读取的同步性也提高了反应精度，扩增产物也可进行实时定量检测，操作简便，结果可靠[24]。

巢式PCR利用2套引物进行2次扩增，根据DNA模板序列设计2对引物，利用第1对引物（外引物）对靶DNA进行15～30个循环的标准扩增，之后将部分100～1 000倍稀释的扩增产物作为二次扩增的模板，依据目的基因设计第2次扩增的引物（内引物），再进行15～30个循环的扩增，第2次扩增产物的DNA片段为第1次扩增产物的内部碱基[25]。由于巢式PCR首先用第1引物对样本内的原始DNA模版进行扩增，再进行第2次扩增和检测，运用双引物特异性的累加，使特异性和灵敏度高于普通PCR，这一特点十分有利于唾液和粪便等幽门螺杆菌含量低的样本的检测，也适用于胃出血或正在服用质子泵抑制剂的患者样本的辅助检测[26]。ISMAIL等[27]采用巢式PCR和组织病理学方法检测49例幽门螺杆菌感染者的牙菌斑样本，发现巢式PCR的敏感性（40.8%）略高于组织病理学方法（36.7%）。FERNÁNDEZ-TILAPA等[28]为研究无消化不良症状人群口腔中幽门螺杆菌的感染率和vacA基因，采集了200名无症状成年人的牙菌斑和唾液样本，分别采用实时荧光定量PCR、半巢式PCR和巢式PCR对样本进行检测，并与血清学抗体检测结果进行比对，发现口腔幽门螺杆菌的阳性率为17%，且有些样本中存在多种vacA基因型。提示无症状感染人群中血清学检测阳性者口腔幽门螺杆菌阳性率比阴性者高，表明无症状感染者口腔中可能存在多种基因型的幽门螺杆菌菌株。

2.1.2 口腔幽门螺杆菌与胃幽门螺杆菌的相关性

口腔幽门螺杆菌基因型与胃黏膜幽门螺杆菌的比对结果可以验证2个不同部位的幽门螺杆菌是否有相关性或同源性。ZOU等[21]通过荟萃分析，比较了PCR检测胃幽门螺杆菌与口腔幽门螺杆菌的检出率，结果表明，胃幽门螺杆菌阳性患者口腔幽门螺杆菌阳性检出率比胃幽门螺杆菌阴性患者高，提示口腔中的幽门螺杆菌与胃部幽门螺杆菌具有一定相关性。

为研究慢性胃炎患儿口腔与胃部幽门螺杆菌是否具有同源性，CAI等[29]收集了235例患儿胃镜检查前的口腔样本和胃黏膜样本，采用PCR检测16SrDNA基因和cagA基因，结果显示，有46例患儿胃幽门螺杆菌阳性，其中26例患儿口腔和胃黏膜幽门螺杆菌的16SrDNA基因均阳性，且这26例患儿中，有12（46.1%）例口腔幽门螺杆菌的cagA基因阳性，明显低于胃黏膜幽门螺杆菌cagA基因的阳性率（80.8%，P=0.010）；口腔和胃黏膜样本序列比对的同源性范围为74.0%～92.1%，证实了在同一个体中口腔幽门螺杆菌与胃部幽门螺杆菌具有较高的同源性。

2.1.3 口腔在幽门螺杆菌传播过程中的作用

有研究发现，居住环境、家庭人数、饮食习惯和卫生条件等与幽门螺杆菌感染率有一定的相关性，说明幽门螺杆菌很有可能从一个个体直接传播到另一个个体，也说明了口-口途径和粪-口途径是幽门螺杆菌在人群中最有可能的传播方式[30]。IWAI等[31]采集了192例患者的牙菌斑和唾液，采用巢式PCR检测幽门螺杆菌ureA基因，发现有23例患者ureA基因阳性，2例患者牙菌斑样本幽门螺杆菌阳性但唾液样本阴性，提示牙菌斑可能是口腔中幽门螺杆菌存在的主要部位，幽门螺杆菌可能存在从龋齿到根管的传播路径。

MOMTAZ等[32]通过比对胃黏膜、粪便与唾液样本中的ureC、vacA和cagA基因，发现不同类型样本中有高度相似的幽门螺杆菌基因型，证实了幽门螺杆菌主要通过粪-口途径传播和口腔是幽门螺杆菌另一重要的储存场所的结论；同时，3种样本中显著不同的基因型也表明同一患者体内可能存在多种基因型的幽门螺杆菌。

2.1.4 口腔幽门螺杆菌在诊断胃幽门螺杆菌感染中的作用

由于口腔幽门螺杆菌和胃幽门螺杆菌之间的基因型存在一定的相关性，通过口腔幽门螺杆菌基因型的鉴定可为口腔幽门螺杆菌的感染类型和患者疾病类型的诊断提供一定的依据[33]。为评估患者胃幽门螺杆菌的感染类型，TIWARI等[34]收集了55例十二指肠溃疡患者、25例胃溃疡患者和40例无症状感染者的唾液样本，采用PCR检测样本中cag毒力岛的多种基因，发现与无症状感染者的cagE基因和cagT基因所占比例（77.5%和85%）相比，胃溃疡患者这2种基因所占比例（92.5%和96.2%）更高，证实了唾液是一种可靠的检测毒力基因的无创性样本，也提示cagT基因作为重要的细胞毒素相关基因，很大程度上会导致人发生胃部疾病。

2.2 粪便样本幽门螺杆菌的分子检测

粪便成分非常复杂，主要包含各种微生物、无机化合物、胆盐、多糖、未消化的植物纤维和大量降解酶等。粪便中大量快速生长的微生物会抑制微需氧菌幽门螺杆菌等苛养菌的生长[35]。因此，从粪便样本中分离、培养幽门螺杆菌非常困难。此外，粪便的复杂成分可能导致DNA抽提困难。选择合适的类便样本的分子生物学检测方法至关重要。

粪便样本中的微生物种群复杂，进行DNA提取后，可能会有一些干扰PCR检测的物质存在于临床样本中[36]。微滴数字PCR的微滴被有限稀释后独立分割形成的数万个独立扩增体系，有效减少了干扰，并保证了即使不超过10 CFU/mL的模版也能得到扩增，提高了检测低幽门螺杆菌模版样本的敏感性。同时，微滴数字PCR统计的是初级模版扩增反应的荧光信号，引用泊松分布，可提高其计算的精确度[37]。TALARICO等[38]用微滴数字PCR测定了79份幽门螺杆菌抗原阳性的粪便样本，16SrRNA基因的检测敏感性为100%，CagA抗体阳性粪便样本cagA基因分型阳性率为88%。另一项研究结果表明，微滴数字PCR可以有效区分克拉霉素耐药基因相关的23SrRNA基因的突变型和野生型位点，以确定幽门螺杆菌对克拉霉素的耐药性[39]。

环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）通过1对外部引物和1对内部引物，可以识别幽门螺杆菌基因序列上6个不同的区域，对幽门螺杆菌基因序列具有高度的选择性[40]。BAKHTIARI等[41]用未感染幽门螺杆菌的健康志愿者的粪便和幽门螺杆菌标准菌株（ATCC 43504）混合制作了8个浓度（1×10-2～1×105CFU/mL）的幽门螺杆菌菌悬液，采用LAMP测定幽门螺杆菌的cagA基因，结果显示，粪便样本幽门螺杆菌低浓度检测限达到1×10-1CFU/mL。张超群等[42]采用LAMP检测幽门螺杆菌感染者无创性样本和胃液样本的cagA基因，并通过稀释模板的检测验证其灵敏度，结果显示，LAMP检测cagA基因的灵敏度是1×102CFU/mL。以上研究结果表明，LAMP检测幽门螺杆菌浓度较低的粪便样本，敏感性较高。

BECKMAN等[43]用TaqMan探针法检测了294份幽门螺杆菌感染者的粪便样本，结果显示，检测灵敏度为93.8%，克拉霉素耐药基因突变位点阳性率为36.2%，并证实了耐药突变基因型与根除感染密切相关。GIORGIO等[44]用实时荧光定量PCR检测了52份幽门螺杆菌感染者的粪便样本和胃活检组织样本的克拉霉素耐药基因突变位点A2143G、A2142C和A2142G，结果显示，有10例（19.2%）为A2143G突变，有5例（9.6%）为A2142C突变，有4例（7.7%）为A2142G突变，表明粪便和胃活检组织样本检测结果是一致的。陈颖婷等[45]采集了120例经胃镜检查显示有胃内疾病的患者的胃黏膜样本和30例幽门螺杆菌感染确诊患者的粪便样本，采用实时荧光定量PCR检测，发现胃黏膜样本幽门螺杆菌阳性率为77.5%、粪便样本为26.92%；而通过普通PCR扩增胃黏膜样本的16SrRNA基因，发现胃黏膜样本阳性率为50%、粪便幽门螺杆菌抗原检测的阳性率为5.55%，提示实时荧光定量PCR鉴定粪便样本幽门螺杆菌有着良好的检测性能。

3 总结与展望

综上所述，传统的13C或14C呼气试验、快速尿素酶检测和血清学抗体检测等方法虽具备各自的优势，但是也均存在一定的不足。口腔和粪便等无创性样本可以实时反映消化道幽门螺杆菌感染的整体性，且患者易于接受，具有较高的临床应用前景。随着的分子生物学研究的进展，更多更加灵敏、特异的技术可从口腔和粪便样本中得到更为准确的检测结果。对口腔和粪便样本进行幽门螺杆菌检测，既可以实时监测人体内幽门螺杆菌的感染情况，又可以对其毒力和耐药性等进行动态分析，为临床的及时诊断、精准治疗和疗效监控提供更加全面、可靠的实验室依据。