TRPM3/miR-204复合位点调控眼部疾病的研究进展

张瑞雪，何 媛

0引言

眼部疾病复杂多样，随着对其发病机制的不断深入探究，基因预防和基因治疗逐渐成为研究热点之一。瞬时受体电位(TRP)通道蛋白是细胞膜上的一类非选择性阳离子通道蛋白家族，TRPM3是TRP家族M亚家族中的一员，对钙离子和镁离子具有一定通透性。微小RNA(miRNA)是长约22个核苷酸的非编码单链小RNA，广泛存在于从病毒到人类的各种生物中，通过对翻译水平的抑制或断裂靶mRNAs来调节基因的表达。目前发现上百种miRNA在眼组织中呈不同程度表达，并与多种眼部疾病的发生、发展密切相关，如血清中miR-23a和miR-34a表达上调通过促进炎症和氧化应激反应从而参与年龄相关性黄斑变性(ARMD)的发生及发展；糖尿病视网膜病变(DR)患者血清miR-146a明显降低，可能通过介导炎症反应和血管增生参与DR的发病[1-2]。越来越多的研究表明，TRPM3/miR-204复合位点在眼组织的发育和眼部疾病的表达调控中发挥重要作用。本文就TRPM3/miR-204分子通路的生物学功能、在眼部的表达与调控及其与眼部疾病的相关性研究进展进行综述。

1 TRPM3/miR-204

TRP阳离子通道超家族在细胞的感应、黏附、增殖、分化和凋亡等多种细胞过程中起重要作用。TRPM3是TRP家族M亚家族中成员之一，编码质膜上的阳离子通道蛋白。TRPM3基因是位于人类9号染色体(9q21.11-q21.12)长臂上最大的基因之一，其长度超过0.9Mb[3]。有研究证实TRPM3的两种错义突变可导致人类遗传性白内障[4]，Bennett等[5]初步研究发现TRPM3内含子2的基因突变与年龄相关性白内障相关。TRPM3的非编码区突变与长寿、低密度脂蛋白及甘油三酯升高、系统性硬化症、阿司匹林加重性呼吸系统疾病和甲状腺结节有关[6-10]。而TRPM3编码区变异可能导致智力障碍和癫痫[11]。TRPM3通道对温度敏感，研究显示其在传感有害温度、调节胰岛素释放和分泌炎性因子方面发挥一定作用[12-13]。

TRPM3含有非编码miRNA基因，与宿主基因同方向共转录，通过对靶mRNAs的切割或抑制mRNAs翻译参与转录后水平基因表达的调控。miR-204位于TRPM3内含子6上[14]，通过调控多种基因的表达增加TRPM3位点的功能复杂性。因此，miR-204的表达受TRPM3启动子调控，也受表观遗传机制的调控[15]。miR-204与TRPM3转录方向相同[16]，有研究表明miR-204的表达模式也与TRPM3大致相同。如在眼部晶状体、脉络膜、视网膜神经元、睫状体和视网膜色素上皮(RPE)细胞中可同时检测到miR-204和TRPM3[16-21]。TRPM3和miR-204也在胰岛素瘤细胞中共表达，miR-204可以调节胰岛素的生成[22]。TRPM3在伴有VHL基因丢失的人肾透明细胞癌(ccRCC)的发生发展过程中也起重要作用，miR-204的直接靶点TRPM3在缺失VHL基因的肾透明细胞癌中表达增加[23]。Butrym等[24]发现位于miR-204上游侧翼的基因突变可造成急性髓系白血病恶化。因此，了解不同特定的TRP通道/miRNA分子通路可能为疾病的靶向治疗提供临床依据。

2 TRPM3/miR-204在眼部的表达及调控

在人眼部，多个TRPM3转录变体存在于晶状体中[5]，且成人RPE细胞系(ARPE-19)的TRPM3转录水平更接近原代RPE细胞[25]。RNA测序证实，TRPM3在人RPE组织、细胞系和晶状体干细胞系中比视网膜或角膜源性细胞中更丰富[26-27]。许多学者在人睫状体、小梁网(HTM)细胞、晶状体上皮中检测到miR-204转录[28-29]，miR-204可调节HTM细胞中多个基因的表达，蛋白质印迹分析显示miR-204的直接靶点蛋白Bcl2l2、BIRC2、EZR、M6PR、SERP1表达水平均下调[29]。miR-204是睫状体中表达含量最多的miRNA，也在角膜、小梁网等与青光眼和圆锥角膜相关的眼组织中表达[30]。TRPM3免疫定位于人胎儿RPE(hf-RPE)细胞的顶浆膜亚区，并富集于顶浆细胞紧密连接处和初级纤毛基底处[31]。小眼球畸形相关转录因子(MITF)参与TRPM3/miR-204分子通路的调控，在去分化的hf-RPE细胞中MITF和TRPM3/miR-204显著下调，将前体miR-204转染到hf-RPE细胞中，可促进细胞分化；而加入miR-204抑制剂则会导致细胞去分化。在hf-RPE细胞中，敲除MITF会降低TRPM3/miR-204及其他RPE分化基因(如TYR、TYRP1) 的表达，导致hf-RPE细胞去分化；相反，MITF和前体miR-204共转染促进了hf-RPE细胞分化，这说明MITF介导的miR-204上调在促进hf-RPE细胞分化中起关键作用[32]。TRPM3/miR-204复合位点在眼组织中呈不同程度表达，且在多种眼部疾病的调控中也扮演重要角色。

3 TRPM3/miR-204与眼部疾病

3.1 TRPM3与白内障TRPM3是晶状体发育和白内障形成的相关基因之一。Bennett等[5]首次证明TRPM3与人类遗传性眼病有关，并定位于染色体9q上，进一步证明该阳离子通道在正常眼组织发育中的重要作用。人类9q染色体上的TRPM3是引起常染色体显性遗传性白内障和高眼压性青光眼的发病基因。全外显子测序和下一代测序技术检测出TRPM3的外显子3中存在与疾病共分离的A/G杂合转变[5]；作为选择性剪接的结果，这种错义突变可能会导致TRPM3转录变体9上密码子65的蛋氨酸被异亮氨酸替代，以及导致密码子8在人晶状体中表达一种新的TRPM3转录变体。对重组TRPM3-GFP荧光蛋白基因产物的瞬时表达研究显示，I/M的替代引入了1个可变的翻译起始位点，该位点位于其他8个TRPM3转录变体的蛋氨酸上游密码子89上[5]。另外，在23例中国儿童散发白内障患者中也检测到位于TRPM3外显子29的错义突变[33]。

3.2 miR-204与白内障研究表明，miR-204的异常表达可能导致晶状体上皮细胞凋亡、晶状体纤维细胞紊乱和晶状体透明度降低，从而形成白内障[34]。miR-204的差异调控与年龄相关性白内障、先天性白内障、糖尿病性白内障和后发性白内障/后囊膜混浊(PCO)的形成相关[35-38]。在年龄相关性白内障手术患者中，miR-204-5p和miR-204-3p在晶状体上皮中央表达下调超过2倍[37]。在PCO组织和晶状体上皮细胞(LECs)中，miR-204-5p和miR-204-3p也显著下调。原代LECs中miR-204-5p过表达导致钙黏蛋白表达增加；而上皮间质转化(EMT)标志物、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和波形蛋白表达减少。miR-204过表达直接作用于DNA结合蛋白SMAD4来加强抑制转化生长因子-β2(TGF-β2)介导的EMT[38]。miR-204通过靶向TGF-β/SMAD信号通路而直接抑制EMT，可能成为治疗PCO的新靶点。miR-204也与白内障氧化应激相关基因的调控相关。miR-204不仅抑制促氧化基因如硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP) 3’-UTR的转录，还激活了抗氧化基因如乙醛脱氢酶1A3(ADH1A3)的5’-TATA-box启动子序列转录[37]。因此，miR-204的下调抑制抗氧化基因并激活促氧化基因，揭示了一种新的参与白内障发病机制的miR204-TATA box/3’-UTR基因调控网络。秦宇等[39]研究发现miR-204在年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜中呈高表达，且miR-204通过靶向调控Bcl-2家族成员bcl-2、mcl-1使其表达降低，从而在年龄相关性白内障发病过程中发挥重要作用。

3.3 miR-204与青光眼miR-204是参与小梁网细胞调控通路的基因之一[40]，而小梁组织是房水的流出途径，与青光眼的病理过程密切相关。G蛋白信号转导调节蛋白5(RGS5)是HTM细胞中表达的非管家基因之一，Banaei-Esfahani等[41]发现miR-204可能靶向调控RGS5蛋白而参与青光眼的发病。在晚期青光眼高眼压视网膜损伤大鼠模型中，miR-204下调了约4倍，还有其他7个miRNAs也显著下调。这些基因富集于细胞外基质(ECM)，并且与EMT相关，这进一步验证了miR-204对TGF-β信号通路的调节作用，即抑制miR-204表达可激活该通路的下游成分[42]。在视神经损伤模型大鼠的视网膜血管中，miR-204表达水平显著升高，生长相关蛋白-43(GAP-43)表达降低；在大鼠眼部注射miR-204模拟物后，GAP-43表达降低，而miR-204抑制剂处理后GAP-43的表达显著增加；注射miR-204模拟物的大鼠和模型组大鼠视网膜细胞凋亡率明显升高，且miR-204抑制剂可有效逆转模型组的凋亡率，说明miR-204通过抑制GAP-43促进视网膜细胞凋亡[43]。

3.4 miR-204与角膜损伤miRNA在角膜发育中起着关键的调节作用。An等[44]建立了一个影响创面愈合结局的miRNA基因网络，并证实该网络通过miR-204的差异表达来调控。在角膜伤口愈合过程中，miR-204的表达下调幅度最大。miR-204转染的人角膜上皮细胞增殖明显下降并诱导细胞周期G1停滞。Gao等[45]研究发现，miR-204-5p在糖尿病患者的角膜上皮中比非糖尿病患者的角膜上皮增加了近5倍，且SIRT1蛋白是miR-204-5p的直接靶点。在高糖条件下，通过调控Cyclin D1和p16可以下调miR-204-5p来增加小鼠角膜上皮细胞系(TKE2)生长，恢复细胞周期进程。下调miR-204-5p可使1型糖尿病模型Ins2(Akita)小鼠SIRT1表达上调，促进角膜上皮创伤愈合。miR-204-5p对SIRT1的调控可促进糖尿病性角膜病变上皮细胞周期循环。miRNA的下调还可促进人类角膜上皮细胞的增殖和迁移，说明其在角膜损伤愈合过程中具有重要作用。

3.5 miR-204与角膜新生血管角膜新生血管(CNV)会导致视力丧失。Kather等[46]研究显示，在KLEIP基因敲除的小鼠角膜营养不良模型中，血管生成素1(Ang-1)表达增加，而miR-204表达减少，致使CNV形成。体外实验证实miR-204的表达缺失调控Ang-1使其表达上调，因此，miR-204是一种新的Ang-1的调节因子。Zhang等[47]研究发现，上皮细胞来源的miR-204可通过调节血管内皮生长因子(VEGF)及其受体的表达来抑制缝线法诱导的小鼠角膜新生血管。miR-204主要在上皮细胞表达，而在有新生血管的角膜中表达下调。在小鼠结膜下注射miR-204激动剂可以抑制CNV，降低VEGF和VEGF受体2的表达。同样，miR-204过表达减弱了VEGF在角膜缘上皮细胞(LECs)中的表达，抑制了人微血管内皮细胞(HMECs)的增殖、迁移和CNV形成。Lu等[48]发现在碱烧伤小鼠CNV模型中，重组腺相关病毒(rAAV)载体转染miR-204后，可使CNV的多种靶基因和通路的表达趋于正常，从而减轻CNV。miR-204作为CNV的内源性抑制基因，是抑制CNV形成的潜在治疗靶点。

3.6 TRPM3与视网膜疾病TRPM3通道存在于整个中枢神经系统，同时也是神经甾体类药物硫酸孕烯醇酮(PregS)的受体。Webster等[49]发现，在发育中的视网膜神经节细胞(RGCs)中，PregS可导致TRPM3通道产生长时间的钙瞬变，并增加RGCs自发性突触电流的频率；而在TRPM3基因敲除的小鼠视网膜中，未发现PregS介导的自发突触电活动增加，证明TRPM3和内源性神经类固醇在视网膜发育过程中调节自发性突触电活动。Brown等[50]提出，在视网膜中，TRP家族的两种基因TRPM1和TRPM3呈高表达，而TRPM3在内丛状层(IPL)、视网膜神经节细胞层(GCL)表达。应用TRPM3激动剂PregS可激活小鼠RGCs中TRPM3依赖性钙信号通路。促炎细胞因子可能导致与ARMD有关的RPE细胞发生功能障碍，Kutty等[51]发现在ARPE-19细胞中，MITF、TRPM1和TRPM3基因以及miR-204和miR-211的表达减少会导致促炎细胞因子、趋化因子和细胞因子的表达增加，认为这些基因可以调节RPE细胞特异性基因的表达。Hughes等[52]研究表明TRPM1和TRPM3在缺乏视杆细胞和视锥细胞的小鼠眼中都受到光的调控，无论是TRPM1缺失还是TRPM3缺失的小鼠，瞳孔光反应都明显减弱。TRPM3还在视网膜Müller细胞和睫状体中表达，而在感光性视网膜神经节细胞中无表达，因此TRPM3在瞳孔光反应中起到间接作用。

3.7 TRPM3与视神经疾病钙离子信号通路的激活是神经胶质细胞对多种细胞外刺激的普遍反应。Papanikolaou等[53]通过小鼠视神经切片和培养物的免疫标记证实，TRPM3通过钙库操纵性钙内流(SOCE)来补充内质网钙离子的存储，并在小鼠星形胶质细胞和少突胶质细胞中表达，结果证明TRPM3是钙通道的重要组成部分之一，支撑SOCE和ATP介导的钙离子信号通道正常且持续发挥作用。

4小结

TRPM3/miR-204复合位点与年龄相关性白内障、青光眼、ARMD等眼部疾病的发病存在显著联系，其在眼的发育、眼部疾病的发生发展及治疗中更是发挥着重要作用。在许多已知TRPM3蛋白表达的组织中，有些通道目前还没有明确其功能作用，未来对TRPM3通道的研究有望在新层面揭示其新功能。随着生物学技术的发展以及对眼部疾病病变机制的不断研究，进一步了解不同眼部疾病特定的TRP通道/miRNA分子通路调控靶基因、调节相关因子表达、影响信号通路的作用机制，从基因水平为预防和治疗眼科疾病开辟新前景十分重要。