长链非编码RNA调控乳头状甲状腺癌的机制研究进展

陈文妤, 吴晨光

(1. 江苏大学医学院，江苏 镇江 212013； 2. 江苏大学附属人民医院内分泌科，江苏 镇江 212002)

甲状腺癌是成人最常见的内分泌恶性肿瘤之一，其发病率逐年升高，在2018年全球癌症统计中，其发病率排第9位[1]。乳头状甲状腺癌(papillary thyroid cancer，PTC)是最常见的甲状腺癌类型，PTC尤其是甲状腺微小乳头状癌的检出率升高被认为是甲状腺癌发病率升高的主要原因，但细针穿刺活检及相关突变基因检测均存在一定的局限性[2]，同时对于PTC可能存在的过度诊断和过度治疗也存在争议。另一方面，虽然与其他病理类型的甲状腺癌相比，PTC的恶性程度较低，治疗效果及总体预后较好，但是10%～15%的患者可出现远处转移、复发或放射性碘治疗耐受，导致整体生存率下降[3]。因此，寻找潜在的生物标志物以在疾病早期阶段识别高风险的PTC患者，提供潜在的治疗靶点，对PTC患者的诊断、治疗、长期管理及预后判断具有重要意义。研究表明，长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)与PTC的发生、发展密切相关。LncRNA能在多个表达层面参与调控基因组转录和翻译过程，为PTC的诊断和治疗提供了新的重要靶点。本文介绍lncRNA调控PTC的机制。

1 LncRNA概述

LncRNA是一类序列长度大于200个单位的RNA分子，主要包括长基因间非编码RNA(long intergenic non-coding RNAs, lincRNAs)和蛋白质编码基因的天然反义转录本[4]。大多数lncRNA具有顺式调控能力，但缺乏翻译和编码蛋白等能力。

与微小RNA(miRNA)相比，lncRNA的功能更加多样化，可在多个表达水平调控基因表达。染色质修饰是lncRNA的一项重要功能。lncRNA可以与染色质修饰复合体相互作用，并通过将这些复合体招募到特定的基因组位点来介导表观遗传变化[5]。LncRNA的另一项重要功能是转录调控，可以直接调节转录基因，也可以靶向转录激活因子影响基因转录。还有研究发现，lncRNA通过形成R环或lncRNA-DNA-DNA三连体结构，直接与DNA结合以调控基因表达[6]。LncRNA在转录后调控中也发挥着关键作用。最近已经发现许多lncRNA通过改变核小体的功能和完整性在转录后水平调控基因表达[7]。有研究发现，lncRNA与多个mRNA转录加工步骤(例如剪接、转运和降解)存在特异性相互作用，一些核定位的lncRNA被发现与核糖体有关，说明lncRNA可能参与翻译调控[8]。此外，lncRNA能编码一种长度在100个氨基酸以内的小肽，与肌肉功能、胚胎发育、肿瘤细胞的增殖等有关[9]。

2 LncRNA在PTC中的作用机制

LncRNA在PTC中起重要调控作用，其异常表达通常与PTC的肿瘤大小、包膜浸润、淋巴结和远处转移、术后复发及放射性碘治疗耐受等相关。LncRNA通过调控信号通路中的关键蛋白表达、基因突变、DNA甲基化或者作为竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)调控下游应答元件，影响肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等细胞功能，是PTC潜在的诊断和治疗的分子标志物。

2.1 LncRNA调控信号通路

现有研究已发现多个信号通路的激活或失活对PTC的发生、进展存在影响，例如磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositide 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB或AKT)[10]，Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)，丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)[11]，核转录因子-κB(nuclear factor κB, NF-κB)[12]，信号转录和激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)[13]，丝裂原激活蛋白激酶激酶1(mitogen-activated protein kinase kinase 1, MAP2K1或MEK1)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)等。近几年的研究认为，lncRNA对PTC的调控作用与这些错综复杂的信号通路密切相关，lncRNA可能调控信号通路中的关键蛋白表达，影响肿瘤细胞的增殖能力和侵袭性。Wang等[14]研究发现lncRNA 溶质载体家族26成员4反义RNA 1(solute carrier family 26 member 4 antisense RNA 1, SLC26A4-AS1)在PTC组织中低表达，其主要定位于细胞核内发挥作用，通过促进MAPK通路中富集的肿瘤蛋白p53表达抑制MAPK通路，进而抑制细胞的侵袭和迁移能力，并促进PTC细胞凋亡。此外，MAPK途径的激活可能抑制SLC26A4-AS1表达。转录因子STAT3 诱导ABHD11-AS1(ABHD11 antisense RNA 1)过表达，通过调节PI3K/AKT信号通路和靶向miR-1303-3p/STAT3轴促进PTC细胞的增殖和转移[15]。肝细胞癌中上调的长链非编码RNA(hepatocellular carcinoma up-regulated long non-coding RNA,HULC)过表达通过促进miR-106a表达增强PI3K/AKT和Wnt/β-连环蛋白信号通路活性，抑制PTC细胞的凋亡，并促进细胞增殖、迁移和侵袭[16]。Sun等[17]研究发现，lncRNA 核富集转录体1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1, NEAT1)在PTC中表达显著上调，其亚型NEAT1-2通过miR-491/谷氨酰胺转氨酶轴激活NF-κB通路，促进转录因子p65发生核异位并与下游纤连蛋白1启动子部位结合，激活纤连蛋白1表达，促进PTC侵袭和转移。此外，lncRNA DOCK9-AS2(dedicator of cytokinesis 9 antisense RNA2,)在PTC中高表达，DOCK9-AS2是一种源自PTC肿瘤干细胞样细胞的外泌体lncRNA，PTC肿瘤干细胞样细胞通过外泌体将DOCK9-AS2传递给受体PTC细胞，定位于PTC细胞的细胞核和细胞质中，通过靶向miR-1972和Sp1转录因子促进β-连环蛋白的编码基因连环蛋白β1表达，激活Wnt/β-连环蛋白通路，促进PTC细胞的增殖、迁移、侵袭、EMT，并增加干细胞特性相关蛋白CD133、胚胎干细胞关键蛋白、性别决定区Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2，SOX2)表达[18]。

2.2 LncRNA调控EMT

EMT是上皮细胞失去极性，获得迁移能力，然后向间充质细胞转化的过程，它参与了胚胎发生过程中组织和器官的形成。目前的研究认为，肿瘤细胞可以重新激活EMT程序，从而增加其侵袭性、干细胞特性和耐药性[19]。已有研究证实了lncRNA异常表达对EMT关键蛋白表达的影响。Zhou等[20]发现lncRNA 肿瘤易感基因2(cancer susceptibility 2，CASC2)过表达增加了上皮型钙黏蛋白(E-cadherin) 的mRNA和蛋白表达，抑制间质细胞标志物E-盒结合锌指蛋白1(zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)和神经型钙黏蛋白(N-cadherin)的mRNA和蛋白表达，从而抑制细胞侵袭。HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)通过激活Wnt/β-连环蛋白信号通路使E-cadherin表达减少，波形蛋白表达增加，进而促进人甲状腺癌细胞株的迁移和侵袭[21]。LINC0163在PTC中表达上调，影响EMT相关分子标志物表达，通过EMT促进PTC细胞增殖和转移[22]。LncRNA SLC26A4-AS1与PTC的总体生存率有关[23]， 能促进EMT的关键蛋白E-cadherin表达，同时使ERK和波形蛋白表达降低，抑制EMT进程[14]。

2.3 LncRNA作为ceRNA

LncRNA参与构建的ceRNA网络是近几年的研究热点，lncRNA靶向miRNA的3′非翻译区，竞争性结合miRNA并降低其浓度，影响具有共同miRNA应答元件的mRNA表达，在转录后水平调控多种病理生理过程[24]。一项基于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)，京都基因与基因组百科全书(kegg kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG)和基因本体论(Gene Ontology, GO)数据库的研究中，运用微阵列表达谱构建了PTC相关的lncRNA-miRNA-mRNA网络，该网络包含21个lncRNA、241个mRNA和803条网络连接，可识别lncRNA 烟酰胺核苷酸转氢酶反义RNA 1(nicotinamide nucleotide transhydrogenase antisense RNA 1，NNT-AS1)作为网络中的中枢节点，通过竞争性结合miR-485与47个mRNA相互作用，且这些mRNA与肿瘤的信号通路有关[25]。此外，一个lncRNA可能与一个或多个miRNA靶向结合，不同的lncRNA也可能靶向同一个miRNA，这种错综复杂的ceRNA调控网络带来的多维累积效应，是lncRNA参与转录后调控的重要机制。

同源框A簇反义RNA 2(homeobox A cluster antisense RNA 2，HOXA-AS2)[26]、HULC[16]等大量lncRNA被发现通过ceRNA网络调节PTC的发生、进展。Ding等[27]研究发现，小核仁RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1)在PTC组织和细胞系中表达上调，SNHG1主要定位于细胞质中，在转录后水平竞争性结合miR-199a-5p激活Sp1表达，从而促进PTC细胞的增殖和侵袭，并在体内促进肿瘤生长。有趣的是，Sp1能靶向SNHG1启动子区域，形成Sp1/SNHG1/miR-199a-5p/Sp1正反馈环，进一步加速肿瘤发生和进展。Liu等[28]发现，尿路上皮癌相关蛋白1(urothelial cancer associated 1，UCA1)在PTC组织和细胞系中上调，与miR-204互补结合，进而调节胰岛素样生长因子结合蛋白5的表达，促进PTC细胞的增殖、侵袭和迁移。Wang等[29]验证了心肌梗死相关转录物(myocardial infarction associated transcript，MIAT)上调与淋巴结转移和较差的临床病理分期有关，MIAT可能通过靶向miR-212促进PTC细胞的增殖、侵袭、迁移，从而促进肿瘤生长。此外，MIAT也能作为miR-324-3p的ceRNA诱导LIM和SH3蛋白1(LIM and SH3 protein 1，LASP1)基因过表达，并可能通过PI3K/AKT信号通路诱导PTC细胞的增殖和迁移[30]。双同源异形盒A假基因8(double homeobox A pseudogene 8, DUXAP8)靶向miR-20b-5p，提高MEK1/2和ERK1/2磷酸化水平，并下调细胞周期蛋白D1和原癌基因c-myc表达，促进PTC细胞增殖并抑制细胞凋亡[31]。DUXAP8也可以通过miR-223-3p/C-X-C基序趋化因子受体4(C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4)轴促进PTC细胞的增殖、迁移和侵袭性[32]。转录因子激活转录因子2(activating transcription factor 2, ATF2)结合lncRNA GAS8-AS1启动子部位调控其表达，GAS8-AS1分别通过GAS8-AS1/miR-187-3p/自噬相关基因5(autophagy related 5, ATG5)轴和GAS8-AS1/miR-1343-3p/ATG7轴抑制PTC细胞增殖并显著促进细胞自噬[33]。CASC7在PTC中起抑癌基因的作用，通过竞争性结合miR-34a-5p，上调肿瘤蛋白p73表达，抑制PTC细胞的增殖和迁移[34]。

LncRNA参与的ceRNA网络除了参与调控PTC细胞的增殖、侵袭、迁移、凋亡、自噬等功能以外，还可能调控PTC细胞对放射性碘治疗的耐受性。放射性碘治疗是分化型甲状腺癌的重要治疗手段，但在治疗过程中肿瘤可能出现失分化导致治疗无效，还有部分患者在自然状态下即可出现放射性碘治疗耐受[35]。LncRNA NEAT1在耐放射性碘治疗的PTC组织和细胞系中过表达，加速增殖并抑制细胞凋亡。NEAT1通过靶向miR-101-3p诱导纤连蛋白1基因表达，激活PI3K/AKT信号通路，降低放射性碘对肿瘤细胞的损害作用。研究发现母系表达基因3(maternally expression gene 3, MEG3)低表达与131I治疗的甲状腺癌患者预后不良有关。Liu等[36]发现过表达的MEG3通过竞争性结合miR-182抑制耐放射性碘的PTC细胞增殖，促进细胞凋亡并诱导DNA损伤，明显提高甲状腺癌细胞对放射性碘的敏感性，但MEG3/miR-182的下游靶基因和信号通路还有待进一步研究。

2.4 LncRNA调控BRAF基因突变

B-Raf原癌基因(B-Raf proto-oncogene，BRAF)基因突变是成人PTC最普遍的一种基因突变，对PTC的病理侵袭性、复发及死亡具有很强的预测价值，与PTC的增殖、转移、耐放射性碘治疗等有关，在PTC中的风险分层和管理中的潜在用途近年来备受关注[37- 38]。其中，BRAFV600E是最常见的类型，存在于半数以上的PTC中。

BRAF激活的非蛋白编码RNA(BRAF-activated non-protein coding RNA, BANCR)是一种与BRAFV600E突变密切相关的lncRNA。Zheng等[39]发现敲除BANCR后可以使促甲状腺激素受体失活从而抑制细胞周期蛋白1表达，将细胞周期阻滞在G0/G1期，减少PTC细胞增殖。其中，促甲状腺激素受体是典型的G蛋白偶联受体，血清促甲状腺激素水平升高与恶性甲状腺结节风险增加有关，二者的相互作用导致甲状腺细胞功能和增殖的改变，可能是甲状腺癌的诱发因素之一。另一项研究发现，BANCR的过度表达使肿瘤干细胞标志物富含亮氨酸重复G蛋白偶联受体5和上皮细胞黏附分子的表达增加，并且上调MAPK信号通路中关键蛋白c-Raf、MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平，BANCR可能通过MAPK途径调控肿瘤细胞的干细胞特性和肿瘤细胞分化[40]。但是，Liao等[41]的研究得到了相反的结果，他们发现与正常甲状腺组织相比，PTC组织中BANCR表达下调，与肿瘤大小和多灶性病变有关，BANCR的过表达使ERK1/2和p38失活，抑制PTC的增殖和转移，并促进细胞凋亡。这些不同的研究结果可能与肿瘤的异质性有关，还需要更大的标本量和更深入的机制研究来解释。

Esposito等[42]研究发现，酪氨酸激酶受体相关基因(correlated to ceptor tyrosine kinase，COMET)是一种天然反义转录本，在BRAFV600E突变或Ret原癌基因重排的肿瘤(即BRAF样肿瘤)中高表达。在PTC中，COMET是属于MAPK信号通路的不同基因共表达网络的一部分，COMET耗尽可导致该网络中基因的表达减少。沉默COMET可抑制BRAF样肿瘤的Ret原癌基因重排，抑制细胞的增殖和侵袭，并提高肿瘤细胞对BRAF突变抑制剂维拉非尼的敏感性。因此，COMET可能是一种潜在的治疗靶标。

2.5 LncRNA参与DNA甲基化调控

LncRNA可参与表观遗传学调控，改变DNA或RNA的甲基化状态，进而控制相关基因的表达。Zhao等[43]发现，Linc00313在甲状腺癌中过表达，通过结合无根状同源异型盒-4(aristaless-like homeobox 4, ALX4)启动子区域，并募集DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1, DNMT1)和DNMT3B促进ALX4启动子区域的甲基化并抑制其表达，激活AKT信号通路，促进PTC细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT。甲基转移酶富集的lncRNA跨膜通道样蛋白6与丝氨酸/苏氨酸激酶4(serine/threonine kinase 4，STK4)启动子区域结合，通过促进STK4甲基化并降低巨噬细胞刺激蛋白受体1和巨大肿瘤抑制激酶1/2的总蛋白水平来抑制STK4，进而通过Hippo通路促进甲状腺癌细胞增殖，抑制凋亡和自噬[44]。

LncRNA的异常表达可能与DNA或RNA甲基化有关。Li等[45]运用TCGA数据库进行了PTC的甲基化和转录组的综合分析，鉴定了与肿瘤的发生发展相关的483个甲基化驱动的lncRNA，运用随机生存森林分析和COX多因素分析，构建了基于lncRNA表观遗传调控的预后模型，该模型可以预测甲状腺癌患者生存期的独立危险因素。Gou等[46]发现lncRNA AB074169(lncAB)启动子区CpG岛高度甲基化导致其在PTC细胞中表达降低，通过抑制KH型剪切调控蛋白增加周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A的表达，降低细胞周期蛋白依赖性激酶2表达，在PTC发生过程中发挥着肿瘤抑制因子的作用。

2.6 其他

LncRNA可能干预miRNA前体剪切加工为成熟miRNA的过程。三基序蛋白29(tripartite motif containing 29，TRIM29)结合lncRNA细胞骨架调节RNA(cytoskeleton regulator RNA，CYTOR)启动子区域促进其表达，通过失活核糖核酸内切酶，抑制前体miR-873切割为成熟的miR-873-5p和miR-873-3p，影响纤连蛋白1 mRNA的稳定性，进而促进PTC细胞的迁移和侵袭[47]。

3 总结

LncRNA在PTC中的作用及其机制在近几年的研究中取得较多的成果，一些lncRNA被认为是PTC潜在的诊断和治疗的分子标志物。但是，也有部分lncRNA在PTC中的表达水平和作用机制存在争议，需要更大的样本量和深入的机制研究来解决其不一致性。此外，近几年ceRNA的研究热度较高，而例如DNA甲基化、lncRNA与mRNA和蛋白的相互作用、lncRNA的编码功能等其他作用机制也值得进一步地深入探索。LncRNA能否作为新的诊断标志物或治疗靶标进入临床应用，还需要大量的科学研究。