化肥减量配施微生物菌剂对桑叶产量和主要活性成分含量的影响

俞燕芳 黄金枝 林羡 王亚威王丰 彭晓虹 杜贤明 王军文

(1.江西省蚕桑茶叶研究所 330202；2.江西省经济作物研究所 330202；3.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 510610)

近年来，鉴于化肥过量施用的诸多弊端，全国各地积极开展化肥减施增效技术的研究与应用推广。微生物菌剂因为在改良土壤、促进植物生长和提高农产品质量等多方面作用显著正日益受到重视[1～2]。目前商品微生物菌剂主要有发酵类菌剂和功能类菌剂。功能类菌剂由具有解磷、解钾、固氮、拮抗病害等功能的菌株组成。近年来，微生物菌剂已在多种蔬菜、果树和中药材等作物上开展了试验研究并取得了良好的效果[3～6]。

桑树是我国一种重要的经济作物，桑叶中富含蛋白质、碳水化合物和维生素等营养成分，同时还含有多酚和生物碱等活性成分，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗炎、抗癌和抑菌等保健功效，是一种药食两用的植物资源[7～8]。研究表明，不同的施肥条件会影响桑树的生理代谢及活性成分的积累[9～10]。传统蚕桑产业栽桑的目的是获取桑叶养蚕，桑树栽培依赖化肥的现象较普遍，导致土壤肥力下降，肥料利用率降低，桑叶品质下降。目前关于微生物菌剂对桑树生长及品质影响研究甚少。

本研究在适量减施化肥条件下，通过田间试验，探究不同微生物菌剂对桑叶产量及其活性成分的影响，以期为微生物菌剂在桑树栽培上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑树品种为金十，8年生低干桑。枯草芽孢杆菌(200亿/g)、绿色木霉菌(50亿/g)、解淀粉芽孢杆菌(200亿/g)和胶质芽孢杆菌(200亿/g)购自河南省沃宝生物科技有限公司。复合肥(N∶P2O5∶K2O，17∶17∶17)购自新洋丰农业科技股份有限公司。有机肥(总养分11.24%，有机质84.9%，N为3.36%，P2O5为4.55%，K2O为3.33%)购自福建省绿屯生物科技有限公司。

没食子酸、芦丁、1-脱氧野尻霉素(DNJ)标准品和芴甲氧羰酰氯(Fmoc-Cl)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；福林酚试剂、乙腈(色谱级)、甲醇(色谱级)和乙酸(色谱级)购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SK3310HP超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；FW135高速粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；Varioskan LUX多功能酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 施肥处理

试验于2020年2—10月在江西省南昌市南昌县黄马乡江西省蚕桑茶叶研究所试验基地进行。试验区土壤有机质含量为28.2g/kg，全氮1.92g/kg，有效磷6.46mg/kg，速效钾160.59mg/kg。

选择树形、树势相近的桑树，参考微生物肥料田间试验技术规程及肥效评价指南(NY/T1536—2007)，试验共设置7个处理，分别定义为处理1(CK0，未施肥)、处理2(CK1，常规施肥)、处理 3(CK2，减量施肥)、处理4(J1，CK2+枯草芽孢杆菌)、处理5(J2，CK2+绿色木霉菌)、处理6(J3，CK2+解淀粉芽孢杆菌)、处理7(J4，CK2+胶质芽孢杆菌)。4月15日和5月27日施肥，穴施。常规施肥为800kg/hm2复合肥。减量施肥为400kg/hm2复合肥和400kg/hm2有机肥。微生物菌剂施用量为有机肥重量的1%。每个处理 3 个小区，每个小区选择4株作调查。

1.3.2 桑叶产量测定

施肥后，每个处理随机选择12株桑树，分别在4月20日、5月27日、7月18日和9月7日进行桑叶产量调查，4次产量的总和为全年桑叶产量。

1.3.3 桑叶多酚和DNJ含量测定

在每次调查产量时，每个处理分别随机采集相同叶位的嫩桑叶200g左右，60℃烘干后测定总酚和DNJ含量。 DNJ提取及含量测定方法如下[11]：称取0.1g桑叶粉在10mL离心管中，加 0.05mol/L 盐酸 3mL，涡旋1min后超声30min，10 000rpm 离心10min，取上清液。重复以上步骤提取一次，合并2次上清液，用 0.05mol/L 盐酸定容至10mL。在5.0mL离心管中加入100μL提取液(或不同浓度DNJ标准溶液)和100μL硼酸钾缓冲液(0.4mol/L， pH值8.5)，再加入200μL的 FMOC-Cl溶液 (5mmol/L)，混匀后 25℃水浴反应 20min，加入100μL甘氨酸(1mol/L)终止反应，再加入100μL醋酸水(1%)及400μL超纯水，以0.45μm 微孔滤膜过滤，采用高效液相色谱(HPLC)测定DNJ含量。液相色谱条件为：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(4.6mm× 250mm，5μm)，进样量10μL，流动相为乙腈：0.1% 醋酸(1∶1，v/v)，流速 0.5mL/min，柱温25℃，荧光检测器激发波长254nm，发射波长322nm。以峰面积和对应 DNJ 标准溶液的质量浓度为坐标绘制 DNJ 标准曲线，根据标准曲线线性回归方程计算每个样品的 DNJ 含量。

桑叶多酚提取及含量测定方法如下：称取干燥桑叶粉 0.5g，加入80%乙醇15mL，超声提取30min，10 000r/min 离心15min，取上清液。重复以上步骤提取2次，合并3次上清液，用 80% 甲醇定容至50mL，作为酚类物质提取液待测。总酚含量测定方法如下[12]：以没食子酸溶液为标准对照，样品测定结果表示为mg没食子酸当量/g 干重(mgGAE/g DW)。将25μL标准品或样品加入到96孔酶标板中，再加入125μL福林-酚试剂(0.2N)，室温下反应10min后加入125μL的饱和Na2CO3溶液，在振荡器上缓慢摇匀后室温放置 30min，然后在 765nm下测定吸光度。

1.3.4 数据分析

用IBM SPSS Statistics 22.0进行数据统计分析，结果以平均值±标准差表示。采用单因ANOVA进行平均值比较，利用Duncan法进行差异显著性分析，用OriginPri8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同微生物菌剂对桑叶产量的影响

如图1所示，CK0处理(未施肥)的桑叶产量最低，J3处理(CK2+解淀粉芽孢杆菌)的产量最高。与CK1处理(常规施肥)相比，CK2(减量施肥)的桑叶产量下降了0.1kg/株。J1(CK2+枯草芽孢杆菌)、J2(CK2+绿色木霉菌)、J3(CK2+解淀粉芽孢杆菌)和J4(CK2+胶质芽孢杆菌)的桑叶产量均高于CK2。但是，各处理组的桑叶产量无显著性差异(P>0.05)。

图1 不同微生物菌剂处理桑叶产量比较

2.2 不同微生物菌剂对桑叶多酚含量的影响

如图2所示，在试验期内不同处理组桑叶的多酚含量总体均呈下降趋势。在5月27日，CK2处理桑叶多酚含量显著高于CK1，J2处理和J4处理桑叶多酚含量与CK2没有显著性差异(P>0.05)，J1和J3多酚含量显著低于CK2(P<0.05)。在7月18日，J3多酚含量显著低于其他处理组(P<0.05)。在9月7日，与CK2相比，J4多酚含量显著增加，而J2和J3多酚含量显著降低(P<0.05)。

图2 不同微生物菌剂处理桑叶多酚含量比较

由此可见，在不同的生长时期，微生物菌剂对桑叶多酚的含量存在不同程度的影响。在减量化肥的基础上，施用胶质芽孢杆菌剂(J4)能够增加桑叶多酚含量，而施用解淀粉芽孢杆菌剂(J3)会降低桑叶多酚含量。

2.3 不同微生物菌剂对桑叶DNJ含量的影响

如图3所示，在试验期内桑叶中的DNJ含量呈先上升后下降的趋势，在7月18日采摘的桑叶DNJ含量最高。在7月18日和9月7日，CK2桑叶的DNJ含量显著高于CK0和CK1，与CK2相比，J1显著增加桑叶DNJ含量(P<0.05)。在7月18日，与CK2相比，J3显著降低桑叶DNJ含量(P<0.05)。在9月7日，与CK2相比，J4显著降低桑叶DNJ含量(P<0.05)。J2和CK2在5月27日差异不显著，但在7月18日开始差异显著(P<0.05)。由此可见，减量施肥可以增加桑叶DNJ含量，不同微生物菌剂会影响桑叶DNJ的合成与积累，施用枯草芽孢杆菌剂(J1)和绿色木霉菌剂(J2)能够增加桑叶DNJ含量，而施用解淀粉芽孢杆菌(J3)和胶质芽孢杆菌剂(J4)会降低桑叶DNJ含量。

图3 不同微生物菌剂处理桑叶DNJ含量比较

3 讨论与结论

施肥是提高桑叶产量和改善桑叶品质的主要手段。有研究表明，在减量化肥基础上增施有机肥和微量元素能够改善土壤理化性状，提高桑树光合性能，提高果桑产量和果实品质[9]。本试验结果表明，增施微生物菌剂，可以提高桑叶产量，但影响不显著，这可能与微生物菌剂施用的浓度以及大田环境复杂性有关。杜红[13]研究表明，中等浓度胶质芽孢杆菌(0.10g菌剂/kg土)显著提高油菜产量，高浓度(1.00g菌剂/kg土)会抑制油菜的生长[13]。

多酚和DNJ是桑叶中的重要活性成分，是桑叶发挥降血糖、降血脂和抗菌消炎等功效的重要物质基础[14～15]。本试验结果表明，施用微生物菌剂显著影响桑叶中的多酚和DNJ含量。其中，施用胶质芽孢杆菌剂(J4)能够增加桑叶多酚含量，而降低桑叶DNJ含量；施用解淀粉芽孢杆菌剂(J3)会降低桑叶多酚和DNJ含量；施用枯草芽孢杆菌剂(J1)和绿色木霉菌剂(J2)能够增加桑叶DNJ含量。这可能与微生物菌剂影响光合作用从而影响植物的代谢活动有关。汪晶晶等[16]研究发现，海洋解淀粉芽孢杆菌GM-1菌剂处理水稻，水稻叶片中总酚和黄酮含量明显提高。王爱斌等[17]研究表明，酵素菌肥、EM菌堆肥、木霉菌制剂、枯草芽孢杆菌制剂和阿维菌素有机肥，都能促进蓝莓叶片氮、磷、钾、叶绿素、可溶性蛋白、可溶性糖和总酚的积累。叶如梦等[18]比较了在不同土壤养分(贫瘠组、营养组)条件下，灌根接种内生枯草芽孢杆菌B117对香蜂花生长生理及总酚、总黄酮、迷迭香酸含量的影响，结果表明在营养组中接菌能显著降低营养组总酚和迷迭香酸含量，而在贫瘠土壤中接菌效果并不显著。可见，微生物菌剂对植物次生代谢物的影响因植物种类、栽培环境等条件不同而不同。

综上，在减量施肥基础上施用一定剂量的枯草芽孢杆菌剂(J1)或绿色木霉菌剂(J2)，能够促进桑叶DNJ的合成与积累，而施用胶质芽孢杆菌剂(J4)，可促进桑叶多酚的积累，其作用机制还有待于进一步研究。