反溶剂法制备玉米醇溶蛋白-海藻酸钠复合微粒研究

安丰豪，曹煜婕，姜珊珊，刘佶轩，李 明

（通化师范学院食品科学与工程学院，吉林通化 134001）

玉米醇溶蛋白是存在于玉米胚乳中的一种醇溶性蛋白，约占玉米蛋白总量的60%[1-2]。虽然玉米醇溶蛋白不溶于水，但由于其含有50%以上的疏水性氨基酸，因此该蛋白质可溶解于乙醇溶液、高浓度尿素、碱性pH 值（＞11）缓冲剂和阴离子表面活性剂中[3]，并且可以通过自组装转化为具有两亲性的微/纳米颗粒，用于运载疏水性活性物质，提高其稳定性和生物利用率[4-8]。然而，玉米醇溶蛋白单独作为载体使用时，其稳定性并不理想，对pH、离子强度和温度的变化敏感。多糖作为天然材料已被广泛用于食品工业，具有高度的稳定性、生物相容性和生物可降解性。由于多糖在分子链上带有天然电荷（离子或非离子）和各种基团（羟基、羧基、氨基等），因此多糖可以通过化学交联、物理交联、多离子复合物和自组装等方式与蛋白质一起参与微/纳米载体的制备[9-10]。因此，玉米醇溶蛋白常与多糖反应制备复合微粒以提高其稳定性。

玉米醇溶蛋白-多糖复合微粒的制备多采用反溶剂法（anti-solvent），也称为液-液分散法（liquid-liquid dispersion）。目前，在玉米醇溶蛋白-多糖复合微粒的研究中，多集中于稳定性及生物活性物质的运载方面，对制备方法则鲜有报道。Joye 等[11]提出，反溶剂法制备微/纳米颗粒的过程中，混合技术（搅拌或超声波）、添加顺序（溶剂向反溶剂中加入或反溶剂向溶剂中加入）、添加方式（滴加或倒入）、反溶剂与溶剂的比例、化合物浓度、温度和稳定剂等都可能会对产品特性产生影响。因此，本研究重点考察了不同制备技术对玉米醇溶蛋白-海藻酸钠复合微粒特性的影响，以期促进蛋白质-多糖复合微/纳米颗粒技术的深入研究和推广应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米醇溶蛋白，Z3625，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；海藻酸钠、无水乙醇、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸、氢氧化钠，分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

水浴锅，DK-S24，上海精宏实验设备有限公司；旋转蒸发仪，RE-3000A，上海亚荣生化仪器厂；分光光度计，722N，上海仪电分析仪器有限公司；高速分散均质机，FJ-200S，杭州齐威仪器科技有限公司；真空冷冻干燥机，LGJ-12，北就松源华兴科技发展有限公司；傅立叶红外光谱分析仪，Nicolet iS20，赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 复合微粒制备

方法一（F1）：将玉米醇溶蛋白溶于80%乙醇后得到玉米醇溶蛋白乙醇溶液，将其滴入海藻酸钠水溶液中，边滴边搅拌，搅拌速率为10 000 r/min，混合后继续搅拌5 min，然后旋转蒸发除去乙醇，用蒸馏水定容至原体积，得复合微粒溶液，进行稳定性检测。

方法二（F2）：将海藻酸钠溶液滴入玉米醇溶蛋白乙醇溶液中，其他操作同方法一。

方法三（F3）：将玉米醇溶蛋白乙醇溶液缓慢倒入海藻酸钠溶液中，其他操作同方法一。

方法四（F4）：将海藻酸钠溶液缓慢倒入玉米醇溶蛋白乙醇溶液中，其他操作同方法一。

方法五（F5-分阶段制备）：将玉米醇溶蛋白乙醇溶液滴入蒸馏水中，边滴边搅拌，搅拌速率为10 000 r/min，混合后继续搅拌5 min，然后旋转蒸发除去乙醇，用蒸馏水定容至原体积，得玉米醇溶蛋白微粒悬浮液，然后将玉米醇溶蛋白微粒溶液与等体积海藻酸钠溶液混合，得复合微粒溶液，进行稳定性检测。

1.3.2 红外光谱检测

复合微粒溶液经冷冻干燥后得固体样品，取一定量固体样品进行ATR-FTIR 检测，检测所得各样品红外光谱数据经标准化处理后进行对比分析。

1.3.3 稳定性检测

复合微粒的稳定性主要表现在当环境发生变化时，微粒是否易于发生聚集甚至沉淀。复合微粒聚集时，粒度增加，粒度变化可由样品的透光度反映出来[12]。在一定条件下，当样品的透光度降低，说明复合微粒发生聚集，粒度增加，溶液浑浊度增加。因此，复合微粒溶液的透光度可反映样品微粒的聚集状态，从而判断复合微粒的稳定性。

（1）pH 稳定性

吸取1 mL 复合微粒溶液，加入19 mL 磷酸盐缓冲溶液（pH 3～8），混匀，在波长500 nm 条件下测定溶液的透光度。

（2）离子强度稳定性

NaCl溶液浓度分别为200、400、600、800、1 000 mol/L。吸取1 mL 复合微粒溶液，加入1 mL、200 mol/L NaCl 溶液，混匀，取1 mL 混合溶液，再加入19 mL、100 mol/L NaCl 溶液稀释，在波长500 nm 条件下测定溶液透光度。其它不同NaCl 浓度条件下的离子强度稳定性检测方法同上。

（3）热处理稳定性

吸取1 mL 复合微粒溶液，加入19 mL 水，混匀，分别置于45、55、65、75、85、95、100 ℃水浴中，加热15 min，在波长500 nm 下测定溶液透光度。

1.4 数据处理与分析

每组实验均至少重复3 次，结果表示为平均值±标准差。应用Origin 8.5 进行数据处理，并采用最小显著差数法（LSD）进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 制备方法对复合微粒稳定性的影响

2.1.1 制备方法对复合微粒pH 稳定性的影响

由图1 可知，pH 变化对F1 的稳定性影响不显著，但对F2～F5 具有显著性影响（P＜0.05）。说明F1 对pH 变化的稳定性相对较好。除F1 和F4 的透光度比较接近外，其它方法制备所得样品的透光度在数值上相差较大，其中F3 的透光度最高，其次是F1、F4、F2 和F5，说明F3 制备的微粒粒度最小，其次是F1、F4、F2 和F5。由以上结果可得，F1 的pH 稳定性最好，F2 的稳定性最差；F3的粒度最小，F5 的粒度最大。因此，在复合微粒制备过程中，玉米醇溶蛋白与多糖溶液的添加顺序、混合方式（滴入、倒入）以及复合方式（F5）对pH 变化的敏感度不同，所得微粒的粒度也不同，是在微粒制备时需要重点考察的因素。

图1 制备方法对复合微粒pH 稳定性的影响Fig.1 Effect of preparation method on pH stability of composite microparticles

2.1.2 制备方法对复合微粒离子强度稳定性的影响

由图2 可知，离子强度的变化对复合微粒的稳定性有显著影响（P＜0.05）。其中，F1 在200 mmol/L NaCl 条件下透光度最高，在300～500 mmol/L NaCl 范围内变化不显著；F2 在100～300 mmol/L NaCl 范围内变化不显著，但在300～500 mmol/L NaCl 范围内先下降后上升；F3 在100～300 mmol/L NaCl 范围透光度逐渐下降，在300～500 mmol/L NaCl 时透光度先上升后下降；F4 在100～500 mmol/L NaCl 范围内先上升后下降，300 mmol/L NaCl时透光度最高；F5 在100～500 mmol/L NaCl 范围内变化显著（P＜0.05），在400 mmol/L NaCl 时透光度最低。通过以上分析可得，5 种制备方法对离子强度的变化都较敏感，透光度随离子强度的变化呈现不同的变化趋势。由极差比较可得，在100～500 mmol/L NaCl 范围内，F1 的透光度变化相对最小，F2 的透光度变化相对最大，因此，各制备方法对离子强度的相对稳定性由大到小依次是F1＞F5＞F3＞F4＞F2。

图2 制备方法对复合微粒离子强度稳定性的影响Fig.2 Effect of preparation method on ionic strength stability of composite microparticles

2.1.3 制备方法对复合微粒热处理稳定性的影响

透光度可通过检测样品的混浊度而得，反映了样品微粒聚集程度的大小或微粒粒度的大小[12]。由图3 可知，在45～100 ℃范围内，不同制备方法所得复合微粒的透光度对温度的变化比较敏感（P＜0.05），说明热处理对复合微粒稳定性的影响显著。5 种制备方法所得的复合微粒中，F1 对热处理的稳定性相对较好，F5 对热处理的稳定性相对最低。

图3 制备方法对复合微粒热处理稳定性的影响Fig.3 Effect of preparation method on thermo stability of composite microparticles

综上所述，在复合微粒制备过程中，不同的制备方法对所得微粒的透光度有显著影响，说明不同方法所得微粒的粒度大小差异明显，同时，不同制备方法所得微粒的稳定性也不同。因此，在利用玉米醇溶蛋白和多糖制备复合微粒时，添加顺序、混合方式及复合方式等制备参数都是需要重点考察的因素。

2.2 不同制备方法所得复合微粒的红外光谱分析

傅立叶变换红外光谱技术常用于研究蛋白质与多糖的相互作用，有效地识别功能团。蛋白质重复单元的振动产生一些特征性的红外吸收带，如酰胺A、B 和I～VII 等[13]。

由图4 可知，在玉米醇溶蛋白的红外光谱中，1 644 cm-1和1 531 cm-1分别属于酰胺I 带（1 700～1 600 cm-1区域，主要是C═O 拉伸）和酰胺II 带（1 600～1 500 cm-1区域，主要是C—N 拉伸加上N—H 弯曲模式），3 100～3 500 cm-1是由于羟基的O—H 拉伸振动，CH2反对称和对称拉伸振动的光谱在3 000～2 800 cm-1范围内。在海藻酸钠的红外光谱中，O—H 和C—H 的伸缩振动分别表现在3 242 cm-1和2 925 cm-1[14]，而1 590 cm-1和1 409 cm-1分别来源于COO—和C═O 的伸缩振动[15]，C—O—C 的伸缩振动表现在1 082 cm-1[16]。

图4 玉米醇溶蛋白（A）、海藻酸钠（B）、玉米醇溶蛋白和海藻酸钠的物理混合物（C）、方法1～5（D～H）所得微粒的红外光谱Fig.4 The infrared spectroscopy of Zein (A),sodium alginate(B),zein-alginate physical mixture (C),microparticles obtained from F1～F5 (D～H)

由图4 可知，玉米醇溶蛋白和海藻酸钠粉末混合样品的红外光谱（图4C）与F1～F4 的光谱有显著的区别，说明玉米醇溶蛋白与海藻酸钠的相互作用不是简单的物质混合，而是发生了某些化学反应。有研究显示，蛋白质与多糖之间的相互作用包括离子键、氢键和疏水作用力[10]。由F1～F4 的光谱结果可知（图4 D～G），不同制备方法对样品红外光谱的影响不显著，说明玉米醇溶蛋白与海藻酸钠的作用机制是相同的，不受溶液的添加顺序和混合方式（滴入、倒入）的影响。但是，由图4H 可知，F5 的红外光谱与前4 种样品的红外光谱有显著区别，说明F5 与F1～F4 的反应机制不同。

3 结论

由稳定性研究结果可得，在玉米醇溶蛋白与海藻酸钠复合微粒的制备过程中，添加顺序和混合方式（滴入、倒入）对微粒的稳定性有显著影响，其中，F1 对pH 和热处理的稳定性相对较好。同时，不同制备方法所得复合微粒的粒度不同，由小到大依次是F3＜F1＜F4＜F2＜F5。由红外光谱结果可得，分阶段制备法（F5）与其它方法在微粒的形成机制上有本质的区别，需要进一步深入的研究。