高分辨质谱联合核磁共振波谱技术鉴定色胺类新精神活性物质4-OH-MET和4-AcO-DMT

丁珂然，倪春芳，何思阳，王跨陡，邓乾亚，梁晨

1.复旦大学药学院，上海 201203；2.上海市公安局物证鉴定中心，上海 200083

色胺类新精神活性物质是色氨酸修饰后产生的化合物，由带有双碳侧链的吲哚环组成[1]。其中，赛洛西宾（psilocybin）和赛洛新（psilocin）是致幻蕈类植物的两种主要致幻化合物[2-3]，其结构与神经递质5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）相似（图1A～B），在摄入后能够引起知觉、思维和情绪的剧烈变化，因此在很多国家受到管制[4]。赛洛西宾的化学名称为[3-[2-（dimethylamino）ethyl]-1H-indol-4-yl]dihydrogen phosphate，分子式为C12H17N2O4P，相对分子质量为284，是一种前体毒品，口服后迅速经碱性磷酸酶脱磷，从而产生实际具有精神活性的物质——赛洛新[5-6]。赛洛新的化学名称为3-[2-（dimethylamino）ethyl]-1Hindol-4-ol，分子式为C12H16N2O，相对分子质量为204，主要作为非特异性5-HT 受体的激动剂或部分激动剂，可以结合5-HT1A、5-HT2A和5-HT2C受体产生毒理作用[5，7]。

赛洛西宾和赛洛新最初由HOFMANN 等[8]提取发现，之后不断有合成的赛洛西宾衍生物和天然同系物的相关报道，例如aeruginascin、baeocystin、norbaeocystin、norpsilocin[9-13]等。我国卫计委（原卫生部）早在1996年颁布的《精神药品品种目录》中就已经将赛洛新和赛洛西宾列为第一类精神药品加以控制。然而，不法分子经常对已知活性药物（母药）的结构进行修改，引入某些基团进行结构修饰，从而逃避法律的管制。

本研究对实际案件中的两种可疑粉末进行检验，通过气相色谱-四极杆飞行时间质谱（gas chromatog⁃raphy-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，GC-QTOF-MS）、超高效液相色谱-线性离子阱-四极杆-轨道阱质谱（ultra-high performance liquid chro⁃matography-linear ion trap quadrupole-orbitrap mass spectrometry，UPLC-LTQ-Orbitrap MS）和核磁共振氢谱（1H-nuclear magnetic resonance spectroscopy，1HNMR）等技术并结合NIST 数据库共同确认两种可疑粉末分别为N-甲基-N-乙基-4-羟基色胺（4-OHMET）和N，N-二甲基-4-乙酰氧基色胺（4-AcODMT）。4-OH-MET的化学名称为3-（2-（ethyl（methyl）amino）ethyl）-1H-indol-4-ol，CAS 号为77872-41-4，化学结构见图1C。4-AcO-DMT 的化学名称为3-（2-（dimethylamino）ethyl）-1H-indol-4-yl acetate，CAS号为92292-84-7，化学结构见图1D。

图1 赛洛西宾、赛洛新、4-OH-MET、4-AcO-DMT的化学结构Fig.1 Chemical structures of psilocybin，psilocin，4-OH-MET and 4-AcO-DMT

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

7250 GC/Q-TOF 系统配备7693A 自动进样器以及MassHunter Qualitative Analysis B.07.00 软件（美国Agilent公司），Accela高效液相色谱仪和LTQ-Orbi⁃trap XL 组合式高分辨质谱仪以及Xcalibur 2.0 软件（美国Thermo Fisher 公司），JNM-ECZ600R 核磁共振谱仪（日本电子株式会社）配备Delta v5.0 软件（艾默生过程控制有限公司）；PURELAB Option-R7 超纯水系统（英国ELGA公司）。

甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck 公司），甲酸（色谱纯，瑞士Fluka 公司），内标物普罗地芬、氘代甲醇（美国Sigma-Aldrich公司）。

1.2 样品

由公安机关送检的白色粉末（化合物1）和褐色粉末（化合物2）各约5 g。

1.3 样品处理

1.3.1 高分辨质谱分析样品的处理

取两种检材各约1 mg，分别加入甲醇1 mL，涡旋混合1 min，离心取上清液1 μL 进GC-QTOF-MS。取10 μL 上清液，加入10 mL 甲醇稀释，取10 μL 稀释液进UPLC-LTQ-Orbitrap MS。

1.3.21H-NMR分析样品的处理

取两种检材各约10 mg，分别置于核磁管中，加入氘代甲醇溶液0.6 mL，使样品充分溶解。

1.4 仪器条件

1.4.1 GC-QTOF-MS条件

色谱条件：HP-5ms UI 石英毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm；美国Agilent 公司）；载气为氦气（纯度≥99.999%），流速为1.085 mL/min；初温100 ℃，保持1.5 min，以25 ℃/min程序升温至280 ℃，保持15 min。

质谱条件：电子轰击（electron impact，EI）离子源，能量为70 eV，进样口温度为260 ℃，离子源温度为280 ℃，传输线温度为280 ℃，四极杆温度为150 ℃。采用全扫描模式，质量范围m/z40～600，采集速度为5 spectra/s，溶剂延迟3 min。进样前，使用全氟三丁胺校正液（美国Agilent 公司）对质谱仪的质量轴进行校正，使得质量数相对偏差小于5×10-6。

1.4.2 UPLC-LTQ-Orbitrap MS 条件

色谱条件：Hypersil GOLDTMC18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.9 μm；美国Thermo Scientific公司）。流动相A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B 为含有0.1%甲酸的乙腈溶液。流速为250 μL/min，进样体积为10 μL。流动相梯度洗脱程序为：0～2 min，5% B；2～26 min，5%～100% B；26～28 min，100% B；28～29 min，100%～5% B。

质谱条件：采用电喷雾离子源正离子模式进行检测。离子源电压3.5 kV；鞘气、辅助加热气和碰撞气均使用高纯氮气；辅助加热温度为300 ℃，毛细管温度为350 ℃。质谱检测使用全扫描-信号触发二级质谱（full MS-ddMS2）模式，母离子Q1 全扫描的分辨率设为35 000（半峰宽），子离子Q3 的扫描分辨率为17 500。全扫描范围为m/z50～500，碰撞能量为60 eV。每批次样品进样分析前，采用美国Thermo Fish⁃er Scientific 公司提供的校正液对质谱仪的质量轴进行校正，使得质量数相对偏差小于5×10-6。

1.4.31H-NMR条件

磁场强度9.389766[T]（400MHz），采集点数32768，扫描次数64，接收增益值（receiver gain，RG）38，脉冲角度45°，采集温度20 ℃。

2 结果与讨论

2.1 化合物1的鉴定

2.1.1 GC-QTOF-MS分析结果

白色粉末经处理后进GC-QTOF-MS 检测，其中，化合物1 的保留时间为10.18 min，特征碎片离子有m/z218.141 0、72.080 6（基峰）、160.075 2、146.059 7、44.049 5 等。质谱图经NIST 17 质谱库检索，匹配结果显示，化合物1 与4-OH-MET（分子式为C13H18N2O）的质谱图一致，其中碎片离子m/z218.141 0为其分子离子峰。

通过精确质量数信息可确定碎片离子对应的分子式，并计算出理论质量数和相对偏差，结果见表1。实测质量数与理论质量数的相对偏差均小于5×10-6。

表1 GC-QTOF-MS中化合物1的主要特征离子Tab.1 Main characteristic ions of compound 1 obtained by GC-QTOF-MS

2.1.2 UPLC-LTQ-Orbitrap MS 分析结果

经UPLC-LTQ-Orbitrap MS分析，化合物1的保留时间为6.16 min。化合物1 的一级质谱图见图2A，正离子模式下测得其[M+H]+精确质量数为219.149 4，推断其质子化分子式为C13H19N2O。4-OH-MET 质子化分子离子峰[M+H]+理论质量数为219.149 2，实测质量数与理论质量数的相对偏差小于5×10-6。此外，化合物1的一级质谱图存在同位素簇离子峰m/z220.152 7、221.156 4，二级质谱图（图2B）中主要碎片离子有m/z160.076 3、72.080 8，碎片分子式信息见表2。

表2 UPLC-LTQ-Orbitrap MS中化合物1的主要二级特征离子Tab.2 Main characteristic product ions of compound 1 obtained by UPLC-LTQ-Orbitrap MS

图2 UPLC-LTQ-Orbitrap MS中化合物1的质谱图Fig.2 Mass spectra of compound 1 obtained by UPLC-LTQ-Orbitrap MS

2.1.31H-NMR分析结果

化合物1 的1H-NMR 谱图见图3。其中，化学位移1.14处和2.88处可见甲基和次甲基氢信号，分别为三重峰和四重峰，且相互耦合，归属于结构中与氮原子相连的乙基。化学位移2.57 处的甲基氢信号为单峰，归属于与氮原子相连的甲基。吲哚环上的氢在谱图中的低场区域（化学位移6.76～6.98），与吲哚环上氮原子相连的氢信号出现在化学位移10.73处。

图3 化合物1的1H-NMR谱图Fig.3 1H-NMR spectrum of compound 1

1H-NMR数据信息见表3。

表3 化合物1的1H-NMR数据信息Tab.3 1H-NMR data information of compound 1

2.2 化合物2的鉴定

2.2.1 GC-QTOF-MS分析结果

褐色粉末经处理后进GC-QTOF-MS 检测，其中，化合物2 的保留时间为10.43 min，特征碎片离子有m/z246.135 7、58.065 1（基峰）、160.075 4、146.059 9、42.033 9等。质谱图经NIST 17质谱库检索，匹配结果显示，化合物2 与4-AcO-DMT（分子式为C14H18N2O2）的质谱图一致，其中碎片离子m/z246.135 7为其分子离子峰。

通过精确质量数信息可确定碎片离子对应的分子式，并计算出理论质量数和相对偏差，结果见表4。实测质量数与理论质量数的相对偏差均小于5×10-6。

表4 GC-QTOF-MS中化合物2的主要特征离子Tab.4 Main characteristic ions of compound 2 obtained by GC-QTOF-MS

2.2.2 UPLC-LTQ-Orbitrap MS 分析结果

经UPLC-LTQ-Orbitrap MS 分析，化合物2 的保留时间为7.82 min。化合物2 的一级质谱图见图4A，正离子模式下测得其[M+H]+精确质量数为247.145 0，推断其质子化分子式为C14H19N2O2。4-AcO-DMT 质子化分子离子峰[M+H]+理论质量数为247.144 1，实测质量数与理论质量数的相对偏差小于5×10-6。此外，化合物2 的一级质谱图存在同位素簇离子峰m/z248.148 5 和249.152 3，二级质谱图（图4B）中主要碎片离子有m/z202.087 1、160.076 3、134.060 5，碎片分子式信息见表5。

表5 UPLC-LTQ-Orbitrap MS中化合物2的主要二级特征离子Tab.5 Main characteristic product ions of compound 2 obtained by UPLC-LTQ-Orbitrap MS

图4 UPLC-LTQ-Orbitrap MS中化合物2的质谱图Fig.4 Mass spectra of compound 2 obtained by UPLC-LTQ-Orbitrap MS

2.2.31H-NMR分析结果

化合物2 的1H-NMR 谱图见图5。化合物2 与化合物1 的结构具有相似性，不同之处在于：在化学位移2.62 处有两个甲基氢信号，为单峰，归属为氮原子上的两个甲基；化学位移2.38 处的甲基信号峰，归属为乙酰基团中的甲基；其余氢信号与化合物1 具有相似性，均可得到合理归属。

图5 化合物2的1H-NMR谱图Fig.5 1H-NMR spectrum of compound 2

1H-NMR数据信息见表6。

表6 化合物2的1H-NMR数据信息Tab.6 1H-NMR data information of compound 2

3 结论

本研究运用GC-QTOF-MS 和UPLC-LTQ-Orbi⁃trap MS 两种高分辨质谱技术对未知检材进行分析，结合核磁共振波谱技术对两种缴获粉末进行鉴定，通过精确质量数、同位素簇离子峰和元素组成等信息最终确定化合物为色胺类新精神活性物质4-OH-MET和4-AcO-DMT。

高分辨质谱技术能够获得目标物的精确质量数，是鉴定未知物的常用手段，核磁共振波谱技术能够进一步对化合物进行结构鉴定。这两种方法的联合应用能够得到更加准确的分析结果，为法庭科学提供科学、准确的新精神活性物质鉴定手段。